最新！浙江大學全力打造snRNA-seq平台，揭示癌症研究新靶點！

2023年05月13日19:34:09 科學 1295

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作者：Alan

導讀：FFPE組織構成了一個巨大而有價值的臨床病史和隨訪數據的患者信息庫，然而在組織中獲得單細胞/細胞核rna (sc/snRNA)譜仍然具有挑戰性。

5月12日，浙江大學研究人員在《Nature:Communications》上發表了名為「High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq」的文章，研究人員為臨床FFPE（福爾馬林固定和石蠟包埋）標本提供了一個強大的snRNA-seq平台，可在每個細胞核中檢測到超過3000個基因，並鑒定出25種典型的細胞類型，並有望在生物醫學研究中得到廣泛應用。

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38409-5

研究背景

常規的福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織是最常見的可歸檔標本，構成了一個龐大而有價值的患者資料庫，包括臨床病史、隨訪資料等。然而不可避免的是，福爾馬林固定在FFPE樣品中的大分子上所引起的不可逆修飾總是給分子生物學應用帶來挑戰。近年來，通過優化RNA提取方法或空間原位分析在FFPE樣本的轉錄譜分析方面取得了很大進展。高通量單細胞/細胞核RNA測序(scRNA/snRNA-seq)方法徹底改變了整個生物醫學研究領域。研究人員利用定製的高通量scRNA-seq平台構建了首個人類和小鼠細胞圖譜。臨床FFPE標本中每個細胞的準確轉錄組學特徵能夠更好地了解細胞異質性和群體動態，提高人類疾病的精確診斷、治療和預後。然而由於RNA交聯、修飾和降解，從FFPE組織中分離單個完整細胞/細胞核和捕獲RNA仍然具有挑戰性。

研究方法

為克服這些挑戰，研究人員從不同的角度開發了各種方法。SMART-seq-total9和VASA-seq10通過使用poly(A)跟蹤所有RNA分子捕獲聚腺苷化和非聚腺苷化轉錄本。另一方面，SPLiT-seq11也被報道成功地用於固定細胞，使用隨機引物更有效和更廣泛地捕獲RNA。然而這些方法尚不適用於FFPE組織。在實踐中，總是需要對臨床標本進行大規模和全面的轉錄組學分析，以確定預測性生物標誌物或罕見細胞類型。因此，研究人員目標是找到一種能夠滿足FFPE組織高通量、高靈敏度和高覆蓋snRNA-seq需求的方法。

在這項研究中，研究人員開發了snRandom-seq，這是一種基於液滴的FFPE組織高靈敏度和全長snRNA測序方法。通過使用隨機引物捕獲總rna進行逆轉錄，並通過在第一鏈cDNA上進行poly(dA) tail合成第二鏈。同時也開發了一種在溫和條件下分離FFPE組織中單個完整細胞核的方法，包括脫蠟、再水化和核提取。此外，研究人員還設計了單鏈dna阻斷步驟，避免基因組污染的影響。通過使用人類-小鼠混合樣本來驗證snRandom-seq的性能，結果顯示輕微的重偶率(0.3%)，與最先進的高通量scRNA-seq技術相當。在FFPE小鼠組織中，snRandom-seq在snRNA測序和細胞類型注釋方面結果樂觀，其中snRandom-seq在約20,000個單個細胞核中檢測到每個細胞核中多於3000個基因，並鑒定出25種典型的細胞類型(肝細胞，生殖細胞，成纖維細胞，心肌細胞等)。此外，將snRandom-seq應用於臨床FFPE人肝癌標本，並揭示了具有高增殖活性的細胞核亞群，這可能是癌症研究的潛在靶點。總之，snRandom-seq為實驗室和臨床FFPE標本提供了一個強大的snRNA平台，並在生物學研究和臨床實踐中具有廣泛的應用前景。

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38409-5

snRandom-seq的主要工作流程如圖1所示。對於FFPE組織的單核分離，首先選擇儲存的FFPE組織塊區域並放入管中。用標準二甲苯和酒精洗滌進行脫蠟和復水化。之後，細胞核被解離並滲透。在全面和高通量的單核總rna測序方面，研究人員提供了一種基於隨機引物的化學捕獲=總rna的策略以及一種易於操作的基於液滴的單核標記平台。細胞核分裂成不同的管，用預索引的隨機引物逆轉錄，然後彙集在一起進行後續反應。研究人員也在之前工作的基礎上建立了高通量單核條形碼的微流控平台。聚(dT)引物通過酶切從液滴中釋放出來，同時，DNA通過RNA降解從細胞核中釋放出來。然後聚(dT)引物與cdna末端的聚(dA)尾部結合併延伸，在每個液滴中為cdna添加特定的條形碼。條形碼完成後破壞液滴，擴增條形碼cDNA，並製備下一代測序(NGS)文庫用於配對端測序。

研究意義

在這裡，研究人員開發了一種基於液滴的FFPE組織snRNA測序技術(snRandom-seq)，通過隨機引物捕獲全長總rna。與目前最先進的高通量scRNA-seq技術相比，snRandom-seq顯示出較小的雙偶率(0.3%)，更高的RNA覆蓋率，並且檢測到更多的非編碼RNA和新生RNA。

為實驗室和臨床FFPE標本提供了一個強大的snRNA平台，並在生物學研究和臨床實踐中具有廣泛的應用前景。

參考資料：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38409-5

註：本文旨在介紹醫學研究進展，不能作為治療方案參考。如需獲得健康指導，請至正規醫院就診。