細胞凍存是細胞培養中常見而又非常重要的工作。就像農民種地留種子一樣，我們需要把狀態最好的細胞留存下來，以保證將來有源源不斷的種子用於培養。比如說，可以在我們相對年輕或者說在免疫力比較好的時候，把好的免疫細胞、好的種子儲存起來，等以後我們患病、衰老、或免疫力比較低的時候，就可以把這些年輕的健康的種子拿出來。
何為「最好細胞」？活力四射、長相端正的細胞即為狀態最好的細胞（圖1）。我們可以通過顯微鏡觀察細胞並計數來判斷細胞狀態，以便在合適的時機進行凍存。
圖1 A549人非小細胞肺癌細胞
（左圖密度較低不適合凍存，右圖細胞形態和密度各方面都很好，適合凍存）
細胞也要防凍傷
凍存細胞，不能「一放了之」。
水在低於零度的條件下會結冰。將細胞懸浮在溶液中，隨著溫度降低，細胞外部的水分會首先結冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡；未結冰的溶液中電解質濃度升高，如果將細胞暴露在這樣高溶質的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質分子會受到損壞，細胞便發生滲漏，因此復溫時大量水分會進入細胞內，造成細胞死亡。
如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細胞免受溶質損傷和冰晶損傷。如圖2所示，左圖沒有凍存保護劑，細胞內冰晶較多，右圖有凍存保護劑細胞冰晶明顯較少，原因是冷凍保護劑易與溶液中的水分子結合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，並且通過改變未結冰溶液中電解質的濃度降低其滲透壓摩爾濃度，使細胞免受溶質損傷。1950年smith AU第一次成功利用甘油凍存了紅細胞，發現了凍存保護劑是影響凍存效果的一個關鍵因素。
圖2 有無凍存保護劑時細胞凍存後冰晶產生情況
速降有風險
冷凍速率的控制也很重要。冷凍速率是指降溫的速度，直接關係到冷凍效果。細胞在冷凍過程中會發生如下變化：
當細胞被冷至-5℃時，因溶液中加有冷凍保護劑而降低溶液的冰點，細胞內外溶液仍未結冰。
當被冷至-5~-15℃之間時，細胞外溶液先出現結冰而細胞內仍保持未結冰狀態。細胞內未結冰的水分子會比細胞外部分結冰溶液中的水分子具有更高的化學能。其結果是，細胞內水分子為了和細胞外水分子保持化學能的平衡，會向細胞外流動。當降溫速率太慢時，胞內冰晶的形成風險較低，同時說明細胞脫水最大化；當降溫速度較快，胞內脫水，胞內溶質的含量和細胞收縮都不太嚴重，且細胞暴露在非生理環境的時間更短；當降溫速率太快，沒有充分脫水，就不能阻止胞內冰核的形成。
可見，太快和太慢都不是我們所希望的，而更需要著重優化的是「較快」這種情況。我們需要根據凍存規模選擇不同的凍存方式和設備，以便將降溫速度控制在每分鐘下降1~3℃。
凍存方法的演變
圖3 傳統的棉花包裹凍存
在早期實驗環境相對簡陋的條件下，我們會將細胞包裹至大團棉花或紗布中放入4℃冰箱，然後半小時左右後放入-20℃冰箱，再兩小時左右放入-80℃冰箱過夜，但是這種方式無法穩定地控制實際的降溫速率，目前已逐步被市場淘汰。
圖4 程序降溫盒凍存
如今，商業化的程序降溫盒解決了降溫速率的控制問題，可以做到每分鐘約1℃的緩慢降溫速率。程序降溫盒是通過在夾層內裝入100%異丙醇來進行控溫的。我們可以將細胞凍存管放入凍存盒內部，然後直接放入-80℃冰箱。這個辦法簡單易操作，不過凍存規模較小，無法適應大規模生產的需求。
圖5 程序降溫儀凍存
對於將要上市進行生產的細胞株或者一些比較脆弱的細胞，它們需要更加精確的降溫速率來實現細胞在不同降溫區間所需的降溫速度。很多商業化的細胞程序降溫設備都能實現這一操作，可人工設計並編輯降溫區間、降溫時間、降溫速率，因此能更好地滿足藥物生產和生物學研究所需。
我們會針對目標細胞株設計一系列的篩選實驗，在常規保護劑的基礎上還可根據細胞類型添加海藻糖、白蛋白等，同時對降溫程序進行優化，通過調整降溫速率、時間、區間來平衡樣本溫度和腔體溫度之間的差異，以獲得平滑且適合該細胞的溫度曲線。這種方式做到了對降溫全過程的溫度控制，可以針對不同種類的細胞開發差異化的細胞凍存工藝，同時實現大規模細胞凍存的目標。
圖6 程序降溫儀的降溫曲線
（上方曲線為樣品溫度曲線，下方曲線為腔體溫度曲線）
從「凍」到「存」
前面說的都是怎樣更好地凍細胞，那麼凍完的細胞如何怎樣長期保存呢？
最關鍵的是冷凍保存溫度。冷凍保存溫度是指能長期保存細胞的超低溫度，在此溫度下，細胞生化反應極其緩慢甚至停止，經過長期保存，在復甦後仍能保持正常的結構和功能。不同的細胞和生物體以及使用不同的冷凍保存方法要取得同樣的冷凍保存效果，冷凍保存溫度可以不同，但從實際和效益的觀點出發，液態氮的低溫環境(-196℃)是目前最佳的冷凍保存溫度。在-196℃時，細胞的生命活動幾乎完全停止，但復甦後細胞的結構和功能卻完好。如果冷凍過程得當，一般生物樣品在-196℃下可保存十年以上。應用-70℃~-80℃保存細胞，短期內對細胞的活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯降低。
總的來說，細胞凍存是保障細胞培養的持續穩定進展的重要組成部分。標準化的大規模細胞凍存平台技術的發展，對建立質量優異且均一穩定的生產用細胞庫更是重中之重。
在生物細胞學研究中，有時需要體外培養和分析癌細胞。細胞要養好，就要用好血清，如Ausbian®特級進口胎牛血清，它的內毒素小於3Eu/ml，使細胞更健康，客戶做實驗更加順利。
文章來源於：唐浩 細胞世界
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