Nature | 突破性發現：CREM揭示CAR-NK細胞「疲憊」之謎，抗癌效力有望飆升！

分類：科學
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引言

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, car）技術，特別是car-t細胞療法已在血液腫瘤領域取得了里程碑式的成功，而天然殺傷（natural killer, nk）細胞，作為先天免疫系統的「第一道防線」，其強大的抗腫瘤潛力正被寄予厚望，car-nk細胞療法也因此成為了腫瘤免疫治療的「新星」。

然而，正如任何強大的武器都可能遭遇挑戰，car-nk細胞在複雜的腫瘤微環境中並非總能所向披靡。它們常常會面臨「功能疲憊（dysfunction/exhaustion）」的困境，導致抗癌效果大打折扣。究竟是哪些分子機制在背後操縱著car-nk細胞的「活力開關」呢？儘管目前對tigit、tim3等表面免疫檢查點已有了解，但對於那些可能從細胞內部深層調控免疫細胞功能的轉錄因子（transcription factor），研究仍然有限。
6月4日《nature》的研究報道「crem is a regulatory checkpoint of car and il-15 signalling in nk cells」，在這一未知的領域中取得了突破性進展，揭示了一個關鍵的「幕後推手」——crem（camp response element modulator）。通過對腫瘤小鼠模型中過繼轉移的car-nk細胞進行深入的單細胞轉錄組（single-cell transcriptome）分析，意外地發現，在car-nk細胞發揮效應功能的巔峰期，crem的表達量顯著升高。但更令人費解的是，這種升高既與細胞的激活特徵（如顆粒酶b（gzmb）、溶細胞素（gnly）等抗腫瘤效應基因的上調）同時出現，也伴隨著功能失調的標誌（如tigit、klrg1等抑制性檢查點基因的升高）。這暗示crem可能是一個雙刃劍，既是激活的伴隨，也預示著潛在的疲憊。
進一步的機制探索表明，car活化信號和白細胞介素-15（il-15）刺激都能快速誘導crem的上調，並且這種誘導通過pka-creb信號通路介導。此外，當研究人員通過基因編輯敲除car-nk細胞中的crem時，這些細胞在體外和體內都展現出顯著增強的抗腫瘤能力，能夠更有效地清除腫瘤，增強對腫瘤誘導的免疫抑制的抵抗力，甚至在動物模型中延長了生存期。這一發現不僅為我們深入理解nk細胞功能提供了新的視角，更指明了通過靶向crem來提升car-nk細胞療效的潛在新策略，為攻克癌症帶來了新的希望。
免疫細胞的「疲憊開關」：crem的意外發現
這項研究始於一個大膽的疑問：在car-nk細胞執行抗腫瘤任務時，它們的基因表達發生了怎樣的變化？研究人員深入分析了在小鼠腫瘤模型中過繼轉移後的car19-il-15 nk細胞的單細胞轉錄組數據（single-cell rna sequencing, scrna-seq）。這些細胞被輸注到淋巴瘤小鼠體內，在清除腫瘤的過程中，發現了一個基因的表達量顯著升高——那就是crem。
研究發現，在體內輸注後，car-nk細胞的crem表達量顯著升高，與輸注前相比，在第7天和第14天，平均表達量分別增加了約2.5倍和約3倍，且這種升高與小鼠體內腫瘤控制的改善呈正相關。這似乎在暗示crem與car-nk細胞的抗腫瘤活性密切相關。但更深入的分析卻揭示了其複雜性：這些crem高表達的car-nk細胞，不僅表現出如顆粒酶b（gzmb）和溶細胞素（gnly）等效應基因的升高，暗示它們正在積極攻擊腫瘤，同時也伴隨著如tigit、klrg1等抑制性檢查點基因的表達上調，這通常與免疫細胞的「疲憊」或功能受損相關。這表明，crem可能參與了car-nk細胞在激活狀態下的平衡調控，既有激活的印記，也伴隨著功能失調的信號。
為了進一步探究crem在腫瘤免疫中的普遍性，研究人員分析了來自tisch2資料庫的腫瘤浸潤nk細胞（tumor-infiltrating nk, ti-nk）數據。驚人地發現，在多種癌症類型中，ti-nk細胞的crem表達量普遍高於外周血單核細胞（pbmc）中的nk細胞。特別是在膀胱癌、膽管癌和肺癌中，ti-nk細胞的crem表達量顯著增高。更有趣的是，在胰腺癌患者的轉移性ti-nk細胞中，crem的表達量達到了最高水平，甚至在差異活躍的轉錄因子調控網路中排名前50位。這些數據強烈暗示，crem在腫瘤微環境中的高表達可能與nk細胞的功能受損有關，甚至在某些情況下，高crem表達與患者不良預後（如低級別膠質瘤、肺腺癌、胃腺癌和乳腺浸潤性癌）相關。這進一步強化了crem作為免疫檢查點的潛在角色。
研究人員還利用質譜流式細胞術（mass cytometry, cytof）對nk細胞的表型進行了深入剖析。研究顯示，高表達crem的car-nk細胞（特別是car70-il-15 nk細胞）同時伴隨著激活標誌物（如nkg2d、cd25、cd2、gzmb和perforin）和抑制性標誌物（如nkg2a、lag3、tigit和tim3）的更高表達。這一發現進一步佐證了crem的誘導可能與nk細胞的「激活誘導性疲憊（activation-induced exhaustion）」表型密切相關，它在介導抗腫瘤活性的同時，也可能啟動了負反饋調節機制。
「點火器」的秘密：car激活與il-15如何誘導crem
既然crem如此重要，那麼它究竟是如何被car-nk細胞激活的呢？研究人員深入研究了car活化信號和il-15細胞因子信號對crem表達的影響。
當car-nk細胞與靶抗原（cd70）結合時，crem的表達量在car70 nk細胞中顯著升高，與未轉導的nk細胞或缺乏胞內信號域的car-nk細胞相比，crem mrna表達量可增加約6倍。這明確指出，car分子內部的itam（immunoreoreceptor tyrosine-based activation motif）信號在crem誘導中扮演了關鍵角色。
il-15作為car-nk細胞療法中常用的促增殖和持久性細胞因子，也展示了其對crem的強大誘導能力。il-15能夠以劑量依賴的方式（從50 pg/ml到5000 pg/ml）顯著增加crem的表達，其誘導強度甚至高於等劑量的il-2。當car激活與il-15刺激同時存在時，crem的表達量呈現出疊加效應，這意味著這兩種信號通路可以協同作用來誘導crem。crem mrna的表達在il-15刺激後6小時即可上調，並在24-48小時達到峰值，在96小時內回到基線，顯示出其轉瞬即逝的誘導特性。而在持續分泌il-15的car-il-15系統中，crem則持續高表達。
除了car和il-15，研究人員還測試了其他常見細胞因子和內源性nk細胞受體對crem表達的影響。結果顯示，il-2、il-12和il-18也能劑量依賴性地誘導crem表達，其中il-15的誘導作用最強。此外，通過抗cd16、抗nkp30和抗nkp46抗體激活nk細胞內源性受體，也同樣能上調crem表達。這表明，crem的上調是nk細胞活化的一個普遍特徵，由細胞因子和itam信號共同驅動，並且其強度和動力學特徵因刺激類型而異。
機制揭秘：pka-creb軸的「幕後推手」
既然crem在nk細胞活化中如此重要，那麼其信號通路是怎樣的呢？研究深入剖析了crem誘導的分子機制，揭示了pka-creb信號軸的關鍵作用。
camp信號通路在細胞中扮演著重要角色，而crem正是其關鍵調控因子之一。當細胞內camp水平升高時，蛋白激酶a（pka）會被激活，進而磷酸化轉錄因子creb和crem。這些磷酸化的轉錄因子結合到camp反應元件（camp-response elements, cres）上，調控靶基因的轉錄。研究證實，這一經典的pka-creb軸在car-nk細胞活化中發揮了核心作用。
具體而言，car激活能夠導致car70 nk細胞中creb的顯著磷酸化（pcreb），但這種磷酸化在未轉導或缺乏胞內信號域的car-nk細胞中不明顯。這意味著car分子的cd3ζ鏈信號在誘導pcreb中至關重要。更有力的是，當預處理nk細胞，使用pka抑製劑h89或鈣螯合劑egta時，car誘導的creb磷酸化和crem誘導都被強烈抑制了。這與之前t細胞受體（tcr）信號下游pka磷酸化creb的發現不謀而合。
il-15同樣能以劑量依賴的方式增加pka活性和pcreb水平，且h89和egta也能有效阻斷il-15誘導的creb磷酸化和crem表達。這有力支持了pka-creb軸在car激活和il-15刺激介導的crem上調中扮演的關鍵角色。
研究人員還通過染色質免疫沉澱（chromatin immunoprecipitation, chip）和定量pcr（qpcr）實驗，進一步證實了pcreb能夠強烈結合crem啟動子（crem promoter 1），其結合強度與crem的轉錄水平呈正相關。這表明crem很可能是一個直接被creb調控的靶基因。
值得注意的是，il-15還通過jak-stat通路激活nk細胞，特別是stat3和stat5。數據顯示，il-15能夠劑量依賴性地增加pstat3和pstat5，其中pstat5表現出更高的敏感性。雖然stat3和stat5也參與了crem的誘導（stat3或stat5的缺失部分降低了crem表達），但crem的誘導在car激活後仍能獨立於stat信號發生，主要依賴於pka-creb軸。這揭示了car-nk細胞中crem調控的雙重機制：通過pka-creb信號軸和il-15下游的stat3-stat5通路。
解除「封印」：crem刪除後的car-nk細胞威力大增！
既然crem在nk細胞活化中扮演了複雜的角色，那麼，刪除crem是否能提升car-nk細胞的抗腫瘤能力呢？研究人員運用crispr-cas9基因編輯技術，在car-nk細胞中特異性敲除了crem。
在體外實驗中，crem缺失（crem ko）的car-nk細胞展示出顯著增強的細胞毒性。無論是長期的二維培養、三維腫瘤球體（tumor spheroid）培養，還是腫瘤再挑戰實驗中，crem ko的car-nk細胞都表現出更強的殺傷能力。例如，在針對umrc3細胞的球體殺傷實驗中，crem缺失的car70-il-15 nk細胞在第5天時能夠將腫瘤球體的平均綠色圖像強度降低至對照組的約20%，而野生型細胞僅能降低至約40%，顯示出更有效的腫瘤抑制能力。這種增強效應在低效應-靶細胞比率（effector-to-target ratio）下尤為明顯，且無論腫瘤細胞是否表達靶抗原cd70，crem的缺失都能提升il-15分泌型nk細胞的效應功能，表明crem作為il-15或car信號下游的一個通用抑制性檢查點。
體外效力的提升在體內模型中得到了更有力的驗證。在侵襲性cd70陽性raji伯基特淋巴瘤小鼠模型中，與野生型crem car70-il-15 nk細胞、未轉導nk細胞或未治療對照組相比，接受crem ko car70-il-15 nk細胞治療的小鼠腫瘤控制效果顯著增強，並最終改善了小鼠的生存率。具體而言，crem ko組小鼠的腫瘤負擔在第14天時僅為野生型組的約20%，生存期顯著延長（p值小於0.0001）。此外，crem ko還促進了car-nk細胞在外周血（在第10天和第20天，car+ nk細胞數量分別是野生型組的約2.5倍和約2倍）以及肝臟、肺、骨髓和脾臟中的增殖和浸潤。
在轉移性cd70陽性乳腺癌pdx模型（patient-derived xenograft, pdx）中，接受crem ko car70-il-15 nk細胞治療的小鼠，其肺部和肝臟的腫瘤負擔顯著降低，且car-nk細胞在這些器官中的增殖和浸潤也顯著增加。在胰腺癌小鼠模型中，腹腔注射crem ko car.trop2-il-15 nk細胞也顯著改善了腫瘤控制並延長了細胞的體內持久性。
更重要的是，這些增強的抗腫瘤效果並沒有以犧牲安全性為代價。在多個小鼠模型中，crem ko car-nk細胞的治療耐受性良好，小鼠體重保持穩定，且主要器官的組織學分析未顯示明顯的毒性或異常。這為crem作為car-nk細胞療法的潛在治療靶點提供了堅實的證據。
深度剖析：crem如何重塑car-nk細胞的「命運」？
crem刪除為何能帶來如此顯著的療效提升？研究人員通過染色質免疫沉澱測序（chip-seq）和轉錄組測序（rna-seq）深入探究了crem對car-nk細胞的轉錄和表觀遺傳重編程機制。
轉錄重編程：從「疲憊」到「火力全開」
研究發現，crem作為一種轉錄因子，能夠直接結合到基因組上的多個位點。在crem敲除後，car-nk細胞的基因表達發生了顯著變化。與野生型crem car70-il-15 nk細胞相比，crem ko導致了：
效應基因的上調：如顆粒酶b（gzmb）和干擾素-γ（ifng）的表達顯著升高，這些是nk細胞執行殺傷功能的核心武器。
nk細胞發育轉錄因子的上調：如klf7和runx2，這些因子與nk細胞的成熟和功能密切相關。
疲憊和應激相關基因的下調：如btg1、dusp2、smad3和rgs1，這些基因通常與免疫細胞的功能受損和應激反應有關。
通過基因集富集分析（gene set enrichment analysis, gsea），發現crem敲除顯著上調了對nk細胞效應功能和代謝至關重要的通路，包括myc靶點v1（myc targets v1）、e2f靶點（e2f targets）、mtorc1信號通路（mtorc1 signaling）和氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）。同時，它下調了免疫抑制性通路，如缺氧（hypoxia）和tgfβ信號（tgfβ signaling）。這些發現共同指向一個結論：crem通過直接結合併調控基因表達，促進了nk細胞的功能失調和疲憊狀態，而crem的缺失則逆轉了這一過程，使car-nk細胞能夠保持更強的抗腫瘤活性和增殖能力。
表觀遺傳重編程：解除染色質的「枷鎖」
研究人員進一步通過轉座酶可及染色質測序（atac-seq）分析了crem對car-nk細胞表觀遺傳景觀的影響。在與腫瘤細胞共培養時，野生型crem car70-il-15 nk細胞的染色質可及性（chromatin accessibility）降低，這表明基因組變得更加「緊密」，不利於基因的表達。然而，crem ko的car70-il-15 nk細胞即使在腫瘤微環境中，也能夠維持更加開放的染色質景觀。這意味著crem的缺失使得與免疫細胞激活、代謝和效應功能相關的關鍵基因區域更容易被轉錄機器接觸到，從而促進了這些基因的表達。
具體的分析顯示，crem ko的car-nk細胞在與腫瘤細胞共培養時，在多種細胞代謝和效應通路（包括mtorc1、pi3k-akt-mtor信號通路和有絲分裂紡錘體）相關的基因位點上保持了更高的染色質可及性。此外，ap-1複合體（ap-1 complex）成員（如jun相關因子）、stat家族和cebp家族轉錄因子的結合基序（motif）在crem ko細胞中顯著富集，這些轉錄因子是nk細胞活化和功能的重要調控者，其可及性的增加預示著細胞激活能力的提升。
代謝重編程：更強的「動力引擎」
除了轉錄和表觀遺傳的改變，crem的缺失還顯著改善了car-nk細胞的代謝健康。通過海馬線粒體功能分析（seahorse assays），發現crem ko的car70-il-15 nk細胞展示出增強的糖酵解能力（glycolytic capacity），並有增加線粒體呼吸（mitochondrial respiration）的趨勢。這意味著這些細胞擁有了更強的「動力引擎」，能夠更有效地產生能量以支持其抗腫瘤功能和持久性。
crem——car-nk療法的新靶點
這項開創性的研究首次確立了crem作為car-nk細胞活化中的一個關鍵轉錄檢查點。揭示了car激活和il-15信號通過pka-creb信號軸共同誘導crem，而crem的過度表達則可能導致nk細胞的激活誘導性疲憊。更重要的是，通過基因編輯敲除crem，成功地「解除」了car-nk細胞的「封印」，使其抗腫瘤效力顯著增強，且不增加毒性。
這一發現為car-nk細胞免疫療法開闢了全新的策略。未來的研究還可以著重於：
開發crem特異性抑製劑：直接靶向crem或其信號通路，以期在臨床上增強car-nk細胞的抗腫瘤活性。
優化car-nk細胞設計：將crem的敲除或抑制整合到car-nk細胞的製備流程中，以期獲得更高效、更持久的抗腫瘤細胞產品。
深入理解crem異構體功能：crem有多種異構體，不同異構體的功能可能存在差異，進一步研究其特異性功能可能帶來更精準的調控策略。
car-nk細胞療法正以驚人的速度發展，成為對抗癌症的強大武器。而crem的發現，如同在迷霧中點亮了一盞明燈，指引我們更深入地理解nk細胞功能調控的複雜機制，並為開發下一代更有效、更安全的car-nk細胞療法提供了嶄新的靶點和無限可能。

參考文獻

rafei h, basar r, acharya s, hsu ys, liu p, zhang d, bohn t, liang q, mohanty v, upadhyay r, li p, phadatare p, dede m, xiong d, fan h, jones cm, kunz s, daher m, nunez cortes ak, shanley m, liu b, moseley sm, zhang c, fang d, banerjee p, uprety n, li y, shrestha r, wan x, shen h, woods v, gilbert al, rawal s, dou j, tan y, park jm, reyes silva f, biederstädt a, kaplan m, jiang xr, biederstädt i, kumar b, tiberti s, moore m, jin j, yang rz, muniz-feliciano l, rosemore s, lin p, deyter gm, fowlkes nw, jain ak, marin d, maitra a, chen k, bopp t, shpall ej, rezvani k. crem is a regulatory checkpoint of car and il-15 signalling in nk cells. nature. 2025 jun 4. doi: 10.1038/s41586-025-09087-8. epub ahead of print. pmid: 40468083.

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