引言
哺乳動物的發育過程從單個受精卵開始，經歷高度精確的細胞分裂和譜系分化，逐漸分化出不同的細胞類型和組織。細胞間通過複雜的信號傳遞相互作用，協調其分化和功能。這一過程不僅決定了胚胎髮育的成功與否，也為理解癌症等病理狀態下的組織發生和發展提供了重要線索。因此，重建發育過程中的細胞譜系以及理解其時間順序，對於發育生物學和癌症生物學的研究具有重要意義。
儘管傳統方法（如顯微鏡直接觀察和基於遺傳突變的不可逆記錄）在細胞發育研究中發揮了重要作用，但它們在追蹤細胞狀態動態變化和時間信息方面存在顯著局限性。尤其是在處理多樣且高度動態的細胞行為時，僅靠靜態觀察難以有效揭示細胞分裂和分化的複雜動態。因此，開發一種能夠在體內實時記錄細胞事件的新型技術，成為解決這一挑戰的關鍵。10月30日Nature的研究報道「Temporal recording of mammalian development and precancer」，開發了一種新型的分子時間記錄策略，通過體內標記和追蹤細胞事件的時間順序，結合細胞狀態及譜系信息，從而為理解胚胎髮育和腫瘤發生的時空動態提供新的工具和視角。
癌前期腫瘤發生與進展是腫瘤學中的核心科學問題之一。理解癌前組織的多克隆起源對於闡明腫瘤演化路徑、設計早期診斷手段和制定干預策略具有重要的理論和臨床意義。大多數腫瘤被認為是起源於正常組織中的一個或少數幾個細胞，但癌前期這些細胞往往以克隆形式擴展，並形成高度複雜的遺傳和表觀遺傳多樣性。因此，揭示癌前期腫瘤的多克隆特性及其動態演化，將有助於在腫瘤的早期階段進行更為有效的預防和治療。
該研究採用了一種基於CRISPR的單細胞平台，稱為原生單嚮導RNA捕獲與測序（NSC-seq），該平台可以同時捕獲信使RNA（mRNA）和嚮導RNA（gRNA），通過突變積累模式記錄細胞事件的時間順序。NSC-seq技術的優勢在於能夠將基因表達信息與基因組編輯信息整合，從而利用CRISPR誘導的突變累積，推斷細胞事件的發生順序。這種方法不僅為細胞譜系追蹤提供了時間信息，還能結合基因表達分析以了解細胞的狀態和功能。
在小鼠胚胎中的應用中，研究人員對不同的發育時間點（E7.75、E8.5、E9.5）進行了採樣，並利用NSC-seq技術分析了不同胚胎細胞類型的發育過程和基因表達動態變化。通過捕獲這些時間點的數據，研究人員重建了不同組織在發育過程中各階段的細胞譜系，揭示了組織特異性的發育軌跡及其背後的動態機制。
在人類癌前組織的研究中，研究團隊結合了多組學數據，對418例人類大腸息肉進行了克隆分析，以確定癌前組織的多克隆起源。通過深入分析這些息肉的細胞組成和基因特徵，研究人員識別出不同克隆群體的起源及其相互關係。這一分析為理解癌前期病變的形成機制提供了新的見解，顯示癌前組織可能起源於多個獨立的正常細胞，這些細胞在癌前階段共同參與了病變的形成與擴展。
NSC-seq平台在單細胞水平上捕獲和記錄細胞事件（Credit:Nature）
NSC-seq平台的gRNA捕獲示意圖：圖a展示了NSC-seq平台的gRNA捕獲機制。gRNA的靶標區與NSC-seq的捕獲序列（CS）退火，並通過細胞條形碼和獨特的分子標識符（UMI）進行標記，以實現下游文庫的擴增。
Cas9誘導突變的恢復：圖b比較了通過直接捕獲hgRNA與從相同樣本中DNA檢測到的突變的恢復率，展示了NSC-seq在恢復Cas9誘導突變方面的高效性。
gRNA捕獲效率：圖c評估了在藥物選擇的細胞系中，NSC-seq平台對所有含有sgRNA細胞的gRNA捕獲效率。
轉錄組捕獲效率對比：圖d比較了標準inDrops實驗與NSC-seq實驗之間的轉錄組捕獲效率，顯示NSC-seq在單細胞水平上的捕獲效率具有顯著優勢。
小鼠胚胎中的應用：圖e展示了在發育階段標記的小鼠胚胎中進行的NSC-seq實驗，揭示了隨著時間推移，條形碼區域的積累突變的增加。
線粒體突變變異(mtVar)的檢測：圖g描述了通過線粒體RNA（mtRNA）對體細胞mtVar的檢測過程，並將其用於譜系追蹤，與hgRNA突變作為基準相結合。
多模式應用：圖j展示了NSC-seq平台在多模式上的應用，包括單細胞時間記錄、譜系追蹤以及CRISPR篩選的結合。
組織特異性細胞擴展的時間節點
研究發現，在小鼠胚胎髮育過程中，不同組織的細胞分化在E7.75之後出現顯著差異，標誌著組織特異性的細胞分裂和分化過程在這一階段開始。例如，神經嵴細胞在E8.5之後快速擴展，形成了諸如外周神經系統和色素細胞等多種組織。這一過程受到精細調控，揭示了器官大小和組織分布的關鍵調節機制。
非傳統的細胞發育關係
通過對不同胚胎細胞類型的譜系追蹤，研究揭示了一些非傳統的細胞發育關係。例如，紅細胞祖細胞1（EryPro1）與體節細胞共享共同的譜系祖先，而非通過經典的造血途徑生成。這一發現顛覆了經典的造血系統發育觀點，提示在胚胎髮育後期，體節可能具備更廣泛的發育潛能，從而生成不同功能的細胞類型。
癌前組織的多克隆起源
在人類大腸息肉的研究中，結合小鼠腸道腫瘤模型的分析，研究發現約15-30%的結腸癌前病變起源於多個正常細胞，這意味著這些癌前病變具有多克隆起源的特性。多克隆起源不僅挑戰了傳統的單克隆起源理論，而且指出癌前期病變並非單一細胞獨立演化，而是多個細胞群體在微環境的共同影響下協同參與腫瘤的早期演化過程。
持續存在的祖細胞
研究還發現了一類與腸上皮相關的獨特祖細胞群體，這些細胞從胚胎時期一直延續到成年期，稱為持續存在的腸幹細胞（pISCs）。這些細胞在腸道發育和維持過程中充當干/祖細胞，且其克隆貢獻率顯著高於典型的隱窩柱狀細胞（CBCs）。pISCs的存在提示腸上皮的再生與維持過程不僅依賴於CBCs，還可能涉及在發育早期建立的更具持久性的細胞群體，這些細胞在腸道受損時可能發揮關鍵修復作用。
該研究開發的多模式時間記錄平台為追蹤哺乳動物發育及癌前組織的演化過程提供了強有力的工具。通過對胚胎髮育和癌前組織的詳細時間記錄，研究揭示了不同組織和細胞類型的起源及其分化機制。這些發現對癌症研究具有重要的臨床意義，尤其是在早期干預策略的制定方面。理解癌前期的多克隆起源特性，可能有助於設計針對多個克隆群體的早期干預策略，阻止多種細胞群體同時向惡性轉化的進展。
癌前期病變的多克隆起源為癌症的早期預防提供了新的可能性。如果能夠在癌前期階段檢測出多克隆擴展的特徵，臨床上可以採取多靶點干預策略，以提高癌症預防的有效性。此外，持續祖細胞的發現為理解器官的再生與維持提供了新的理論基礎，未來可以進一步探索這些細胞在組織修復和疾病中的潛在作用，尤其是在腸道疾病和損傷後的再生中，它們可能成為新的治療靶點。
在基礎研究方面，本研究開發的NSC-seq平台具有廣泛的應用前景。該平台不僅限於追蹤胚胎髮育和腫瘤發生，還可以用於研究其他生物學過程，例如免疫系統的發育和功能、神經系統的分化，以及幹細胞在組織修復和再生中的作用。通過與其他單細胞組學技術相結合，NSC-seq有望幫助研究人員更全面地理解細胞在不同生理和病理狀態下的行為及其動態變化。
參考文獻
Islam M, Yang Y, Simmons AJ, Shah VM, Musale KP, Xu Y, Tasneem N, Chen Z, Trinh LT, Molina P, Ramirez-Solano MA, Sadien ID, Dou J, Rolong A, Chen K, Magnuson MA, Rathmell JC, Macara IG, Winton DJ, Liu Q, Zafar H, Kalhor R, Church GM, Shrubsole MJ, Coffey RJ, Lau KS. Temporal recording of mammalian development and precancer. Nature. 2024 Oct;634(8036):1187-1195. doi: 10.1038/s41586-024-07954-4. Epub 2024 Oct 30. PMID: 39478207.
責編|探索君
排版|探索君
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