鎘（Cd）污染對作物生長發育、食品安全和人類健康造成嚴重威脅，並成為潛在的農業和全球環境問題。鋅（Zn）被用於減少土壤和植物中Cd的積累。位於質膜（PM）上的蛋白質在植物逆境信號傳遞中起著重要作用。隨著植物對重金屬的吸收、運輸和耐受機制研究的深入，脅迫相關PM蛋白的研究意義日益凸顯。
2022年5月，來自中國水稻研究所的林曉燕團隊在Journal of Hazardous Materials （IF=14.224）上發表題為「The potential role of plasma membrane proteins in response to Zn stress in rice roots based on iTRAQ and PRM under low Cd condition」的研究文章。該研究利用蛋白質組學和PRM靶向組學技術分析了低鎘條件下水稻根系質膜蛋白對鋅脅迫響應的差異變化，以及差異表達蛋白參與鋅-鎘轉運的響應機制，為進一步研究水稻耐重金屬脅迫、生長發育和代謝調控的分子機制提供了基礎數據參考。中科新生命為其提供了iTRAQ蛋白質組學和PRM靶向定量蛋白組學技術服務。
研究材料：
實驗組（T）和對照組（CK）處理7天後的水稻根部PM蛋白，每組三個生物學重複。
技術路線：
步驟1: 鋅對低鎘處理水稻幼苗鋅和鎘積累的影響；
步驟2: 鋅脅迫下的定量蛋白質組學檢測；
步驟3: 差異表達蛋白的生信分析；
步驟4: 鋅-鎘轉運相關蛋白的研究；
步驟5: 候選蛋白的PRM驗證。
研究結果：
1、鋅對低鎘處理水稻幼苗鋅和鎘積累的影響
低濃度的Zn促進了水稻幼苗中Cd的吸收和積累，導致Cd含量增加，抑制了水稻幼苗的生長（協同效應）;中等濃度的Zn抑制了Cd的吸收和積累，促進了幼苗的生長（拮抗作用）。但是，如果Zn濃度過高，雖然Zn可以抑制水稻中Cd的吸收和積累，但不利於水稻幼苗的生長，甚至對水稻幼苗產生較高的Zn毒性（拮抗作用）。
2、鋅脅迫下的定量蛋白質組學檢測
通過iTRAQ蛋白質組學技術對PM蛋白進行定量檢測，並通過生物信息學分析經過CK和T4處理7天後的水稻根系。從CK水稻根中提取的PM蛋白樣品中共鑒定出14,326個肽段和4,008個蛋白質，其中192個上調，140個下調。
圖1蛋白質組學鑒定數量和火山圖
3、差異表達蛋白的生信分析
通過層次聚類分析可以看出對照組和處理組的每三個重複分別聚集在一起，具有很高的重複性。同時，兩組水稻根系蛋白質表達丰度和表達水平存在顯著差異。
圖2 差異表達蛋白層次聚類分析
對差異表達蛋白（DEPs）的生物學過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組分（CC）進行GO注釋和功能富集度分析，發現PM蛋白對重金屬脅迫非常敏感，在響應重金屬脅迫和減輕重金屬的毒性作用方面起著重要作用。
圖3 差異表達蛋白GO注釋和富集分析
KEGG通路分析發現與植物代謝相關的DEPs主要參與谷胱甘肽代謝、苯丙酸生物合成、光合生物固碳等。谷胱甘肽常被用作植物各種代謝過程中的氧化還原活性劑和解毒化合物，也是運輸和生物合成的中間產物。在本研究中，高濃度鋅對水稻有較強的刺激作用，導致谷胱甘肽活性和含量增加，以抵抗鋅處理的毒性效應。富集分析發現，在重金屬處理下，鉑類耐藥性、α-亞麻酸代謝、內分泌和其他因素對鈣重吸收的調節、囊泡運輸中的圈套相互作用、類黃酮生物合成、ABC轉運蛋白和賴氨酸降解均受到顯著影響。
圖4 差異表達蛋白KEGG通路注釋和富集分析
4、鋅-鎘轉運相關蛋白的研究
在GO分析和KEGG通路分析中記錄了參與Zn2 +和Cd2 +轉運的7個DEPs。其中，3個DEPs上調（A2XQ09、B8B248和B8AAT90）；4個DEPs下調（B8AB68、A0A1B1ELU7、A2XPS1和B8BN76）。PPI互作分析顯示，這7個DEPs中有5個彼此相互作用。
圖 5 差異表達蛋白的PPI互作網路
5、候選蛋白的PRM驗證
建立4種候選蛋白質（B8AB68，B8AAT9，A0A1B1ELU7和B8BN76）的PRM檢測方法進行靶向驗證。結果表明，蛋白A0A1B1ELU7在不同處理中具有相同的表達變化。
圖6 候選蛋白的PRM定量結果
小結
綜上所述，本文利用相對定量蛋白質組學和PRM靶向驗證在蛋白質水平揭示了脅迫響應中Zn/Cd相互作用和跨膜轉運機制，並找到了與水稻根系重金屬攝取和轉運相關的潛在靶蛋白。本研究為水稻根系重金屬脅迫反應蛋白生物標誌物的篩選及抗重金屬脅迫的解毒機理提供了基礎數據參考。
