自古以來就有皇帝、聖人煉丹製藥以尋求長生不老之道的歷史傳統。而隨著經濟水平的發展，平均預期壽命不斷提高，人口老齡化及衰老的問題越來越突出，因此不論是科學家還是普羅大眾，都希望尋找一方良藥來減緩衰老甚至延長壽命。
近期，來自葡萄牙波爾圖大學的Elsa Logarinho團隊找到了一方良藥——轉錄因子FOXM1，並通過小鼠體內實驗證實它具有減緩衰老，延長壽命的作用。在自然衰老小鼠中，提高FOXM1表達可顯著延長中位壽命28%和最大壽命29%，也減緩了衰老相關的體重下降！
這項研究成果近期發表在頂級衰老研究期刊Nature Aging上[1]，讓我們一起來康康吧！
論文首頁截圖
該課題組既往研究發現，在人皮膚成纖維細胞衰老相關的轉錄變化中約60%依賴於轉錄因子FOXM1[2]，而FOXM1是一個關鍵的增殖相關轉錄因子，調控G2/M期基因的表達。在衰老研究領域，有一種觀點認為，細胞增殖能力的喪失是細胞衰老的一個顯著特徵。這些證據都提示，FOXM1與衰老密切相關，那是否可以選擇它作為治療靶點呢？
在該課題組既往研究中，他們在HGPS（Hutchinson–Gilford progeria syndrome，早老症）患者來源的成纖維細胞中過表達FOXM1的N端截短型形式（簡稱FOXM1-dNdK），增強了細胞的增殖能力，同時延緩了細胞過早衰老的發生。這一部分體外的結果已於2018年在Nature Communications上發表[2]。
註：HGPS，早老症，一種早發而嚴重的過早老化性疾病，它是由於編碼A/C型核纖層蛋白的LMNA基因發生點突變而引起。因為HGPS由已知基因突變引起，研究者很容易構建相應的小鼠模型。且因為正常衰老進程是一個很緩慢的過程（即使在小鼠，通常也需要2-3年），而HGPS大大加速了衰老的進程，因此在衰老研究中常選擇HGPS小鼠或人的細胞樣本作為衰老研究模型。
既然體外有療效，那體內效果如何？為了回答這個問題，研究者採用了自然衰老小鼠和HGPS小鼠[3]（LmnaG609G/G609G，簡稱LAKI）來進行研究，在這兩種小鼠中過表達FOXM1來分別觀察在生理性衰老和病理性衰老中是否可以產生抗衰療效。
首先，研究者構建了一個轉基因小鼠，簡稱為LAKI-Foxm1，這個小鼠具備HGPS表型，同時可以通過多西環素（dox）誘導的方式過表達截短的FOXM1。研究者利用該小鼠的耳真皮成纖維細胞，在體外測試了短期過表達FOXM1-dNdK的效率和細胞衰老表型的變化。（這一部分實驗和他們在Nature Communications中的實驗一樣，只不過這裡把HGPS患者的成纖維細胞換成了LAKI-Foxm1小鼠的成纖維細胞。）
結果顯示該系統可將FOXM1過表達5-10倍，包括細胞增殖（Ki67）、DNA損傷（γH2AX）、細胞衰老經典marker（SA-β-gal）、異染色質相關的表觀marker（H3K9me3/H4K20me3）、核膜完整性和核面積等指標均顯示過表達FOXM1可以減輕細胞衰老表型。
在小鼠成纖維細胞中過表達FOXM1可以減輕細胞衰老表型
上述只是短期過表達後即刻檢測的結果，那改善的細胞衰老獲益在撤除FOXM1過表達後能否維持呢？為此，研究者測試了一個循環誘導方案，在來自LAKI-Foxm1小鼠的成纖維細胞中先給予4天的dox處理，然後撤除dox，在撤除的2天和5天後評估細胞表型。
結果顯示即使撤除FOXM1過表達5天後，雖然衰老表型有一定的積累，但仍能夠較好的維持先前4天過表達FOXM1對細胞衰老表型的改善，與未處理的成纖維細胞差異顯著。更讓人振奮的是，在撤除dox 5天後再次給予dox過表達FOXM1能夠進一步阻止衰老表型的再積累。
過表達FOXM1的抗衰獲益具有維持效應
以上證明了該小鼠模型系統可以有效運行，且摸索出了一套循環過表達方案。接下來作者想先看看FOXM1對病理性衰老小鼠是否有治療作用，他們共設置LAKI-Foxm1、LAKI、WT三組小鼠，根據體外結果採用「給3天dox停4天」的策略誘導FOXM1過表達。
研究者想先看看這個潛在治療方式是否對病理性衰老有預防作用，而不是逆轉作用（早期干預相較晚期逆轉可能更易獲得治療陽性結果），因此研究者選用了從4周齡小鼠開始持續上述給dox的策略12周至小鼠16周齡來觀察。
結果顯示，與LAKI對照組相比，dox飲食下的LAKI-Foxm1小鼠的中位壽命和最大壽命延長了約25%（中位，18.1周 vs 14.4周；最大，21.9周 vs 17.7周），且HGPS小鼠中出現的體重下降和生長發育遲緩也在治療後得以改善。值得注意的是，dox處理的LAKI-Foxm1小鼠的屍檢分析並未顯示任何增生組織生長的明顯跡象，說明具有一定安全性（至少沒有長出肉眼可見的瘤子）。
LAKI（HGPS）小鼠中過表達FOXM1能夠延長小鼠壽命
此外，研究者還利用各種表型檢測手段，如3D-micro-CT和小動物超聲，檢測HGPS小鼠的早衰症表型如骨骼缺陷、脂肪代謝障礙（表現為脂肪堆積的減少）、心臟功能障礙是否得到治療恢復。結果顯示，顱面異常和脊柱後凸（駝背）得到顯著改善，皮下脂肪堆積增加，心臟收縮功能和節律得到改善。
病理性衰老小鼠中過表達FOXM1後駝背癥狀得到改善
綜上所述，這些結果表明FOXM1在體內的過表達顯著改善了早衰症的各種特徵，包括致死性心功能障礙，延長了早衰症小鼠的壽命。
接下來，研究者在組織層面（包括皮膚、脂肪、主動脈、骨骼）和分子水平進一步驗證了FOXM1對病理性衰老表型的治療改善效果。各組織在病理層面的衰老變化均有所改善。
重要的是，LAKI小鼠皮膚、性腺脂肪和主動脈中上調的幾種衰老marker在LAKI-foxm1小鼠中均恢復到WT水平。
以上是在病理性衰老，也就是HGPS模型小鼠中得到的結果，然而病理性衰老並不能完全代表生理性衰老，從其發病機制可以看出病理性衰老主要是某一基因突變導致的，而自然衰老是全局性的廣泛改變，二者存在本質區別。
因此，研究者想進一步探究FOXM1過表達是否可以改善自然衰老小鼠的衰老表型？
FOXM1作為一個重要的細胞周期轉錄因子，過表達確實會促進細胞增殖分裂，而長時間「循環」過表達時就不得不考慮其致癌性。且研究報道，癌症中高FOXM1水平與不良臨床結局之間存在關聯，因此，研究者對該方法的致瘤風險提出了質疑。首先得排除較大的風險，才能談治療效果~
碰巧的是，近期有證據揭示了FOXM1的非轉錄端（N端）具有腫瘤抑制功能[4]。且研究者用88周齡Foxm1-dNdk老年小鼠的成纖維細胞（MAF）與4周齡MAF進行體外實驗證實了FOXM1-dNdK誘導確實可逆轉致瘤表型，但具體而言是通過上調內源性Foxm1來起到作用，siRNA干擾內源性Foxm1後致瘤表型恢復證實了這一點。
自然衰老小鼠成纖維細胞中證實FOXM1過表達具有抑瘤效果
（F-actin：皮層肌動蛋白，與腫瘤發生和轉移灶形成正相關）
有趣的是，即使用siFoxm1干擾內源性Foxm1的表達，自然衰老小鼠成纖維細胞的衰老表型仍然被轉基因FOXM1的轉錄功能所改善，說明其抗衰老作用獨立於內源性Foxm1的表達。
自然衰老小鼠成纖維細胞的衰老表型被轉基因FOXM1的轉錄功能所改善
因此，該結果表明，FOXM1轉基因表達可以通過上調內源性Foxm1及其N端功能來糾正致瘤表型，為長期誘導下評估動物的壽命和衰老表型奠定了基礎。
既然目前的證據顯示該治療方法在致瘤性方面是安全的，那接下來就要看看在自然衰老小鼠中的抗衰效果了。
研究者採用8周齡Foxm1-dNdK小鼠，按「給3天dox，停4天dox」的策略過表達FOXM1，共80周，至88周時檢測衰老組織表型（皮膚、肌肉、脂肪、主動脈）和分子水平的變化（RNA-seq）。整個過程中持續記錄生存曲線和體重變化。
過表達FOXM1減緩衰老進程、延長自然衰老小鼠壽命
令人驚訝的是，治療組相較對照組顯著延長了中位壽命（提高28%）和最大壽命（提高29%），也減緩了衰老相關的體重下降。
對組織表型的檢測結果顯示，治療組相較對照組背側皮膚組織穩態改善，皮下脂肪顯著增加；性腺脂肪沉積中脂肪細胞大小有輕微的改善；年齡相關的肌纖維萎縮輕度逆轉；主動脈衰老表型即外膜纖維化、主動脈壁增厚和血管平滑肌細胞丟失均有顯著逆轉。
值得注意的是，為了證明衰老表型確實減弱，而不僅僅是由於FOXM1過表達產生的廣譜益處（gain-of-function），研究者在一個不存在衰老相關表型的階段（14-16周齡），評估了FOXM1轉基因過表達對幼年動物組織的影響。結果顯示以上在組織層面檢測的表型指標沒有顯著變化。提示這不是一個單純的gain-of-function，而確實是針對衰老表型的治療作用。
接下來研究者做了兩組小鼠主動脈和腓腸肌組織的bulk RNA-seq，觀察分子層面的變化以及試圖解析潛在的抗衰老分子機制。GSEA分析顯示在兩種組織中均發生改變的通路主要為炎症和代謝通路。分子水平變化特徵上，該療法與其他已知抗衰老療法類似。
N末端截短的FOXM1循環表達可改善健康和壽命
總之，這些數據支持FOXM1轉基因過表達恢復了衰老過程中FOXM1轉錄和非轉錄功能的丟失，減輕了衰老相關的功能衰退，並通過調節促炎症和代謝途徑的組織特異性分子特徵來抵消生理衰老表型的積累，且與一些公認的抗衰方案的分子特徵呈正相關。
需要注意的是，上述病理性衰老和生理性衰老的小鼠實驗用到的干預措施均是預防性長期干預，而不是在衰老中晚期進行真正意義上的治療。
在細胞和小鼠中預防性治療效果如此好，期待研究者進一步推進衰老中晚期治療及相關大動物實驗並闡明具體的分子機制，希望夠成為早衰症和自然衰老的治療靶點添磚加瓦。
參考資料：
1. Ribeiro, R., et al., In vivo cyclic induction of the FOXM1 transcription factor delays natural and progeroid aging phenotypes and extends healthspan. Nature Aging, 2022. 2(5): p. 397-411.
2. Macedo, J.C., et al., FoxM1 repression during human aging leads to mitotic decline and aneuploidy-driven full senescence. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 2834.
3. Osorio, F.G., et al., Splicing-directed therapy in a new mouse model of human accelerated aging. Sci Transl Med, 2011. 3(106): p. 106ra107.
4. Limzerwala, J.F., et al., FoxM1 insufficiency hyperactivates Ect2-RhoA-mDia1 signaling to drive cancer. Nat Cancer, 2020. 1(10): p. 1010-1024.
本文作者丨李昊桐
責任編輯丨代絲雨
