2012年6月28日，《Science》雜誌在線發表了一篇論文：A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity，[1]宣布了這一在生命科學領域和醫學領域掀起基因編輯革命浪潮的CRISPR-Cas基因編輯技術橫空出世。（圖1）
此後的10年里，CRISPR-Cas基因編輯技術被全世界科學家不斷地開發改良，並將其應用於疾病治療、作物育種、功能基因組研究等多個領域。而該技術的兩位先驅JENNIFER A. DOUDNA和EMMANUELLE CHARPENTIER也於2020年獲得了諾貝爾化學獎，以表彰她們在CRISPR-Cas基因編輯技術發現和研發上的卓越貢獻。
圖1：Science報道CRISPR基因編輯技術
今年是CRISPR-Cas基因編輯技術問世的第10年，那麼這項技術到底給科學界和人類帶來了哪些改變和應用呢？使用Web of Science工具檢索CRISPR相關文獻，我們發現在2012年以前只有零星關於細菌CRISPR序列的研究報道。
2012年以後，對CRISPR-Cas基因編輯技術的研究則是以井噴式的速度被各大期刊報道出來。這其中，加州大學系統、哈佛大學以及中國科學院名列對CRISPR基因編輯技術研究產出最大的研究機構前三甲。（圖2）
圖2：Web of Science檢索CRISPR文獻結果可視圖
CRISPR-Cas基因編輯技術
隨著生命科學研究尤其是基因測序技術的不斷發展，基因編輯技術也逐漸成為了基礎科學研究的有力工具。其中CRISPR-Cas9基因編輯技術的開發憑藉其成本低廉、操作方便、效率高等優點，已逐漸成為繼鋅指核酸內切酶(ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN) 之後的第三代基因組編輯技術，被廣泛地應用於基因編輯領域。
CRISPR-Cas系統最早在細菌和古細菌中被發現，是細菌長期演化過程中形成的一種適應性免疫防禦機制，用來對抗入侵的病毒及外源DNA。該系統其實早在2003年就被西班牙微生物學家Francisco Mojica發現。他提出在細菌和古菌當中廣泛存在一種免疫機制，可在當時這一發現並沒有吸引人們的注意力。於是，這項研究經歷了漫長痛苦的拒稿後（從Nature、PNAS一直到NAR都被殘忍拒稿），最終發表在《分子演化雜誌》。而CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）也由此首次進入人們的視野。
圖3：CRISPR-Cas研究時間線[2]
2013年2月15日，張鋒等人將CRISPR-Cas9技術成功應用於哺乳動物和人類細胞的基因編輯。此後，也發生了張鋒與DOUDNA和CHARPENTIER等人著名的專利權之爭。最終結果在法律上張鋒獲得了CRISPR-Cas9技術的專利權。但三人在該技術上的貢獻也都有目共睹，因此也被人成為「CRISPR三巨頭」。
圖4：CRISPR三巨頭
而隨著全世界科學家們的前赴後繼研究，接連開發出了CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas3、CRISPR-Cas12a等工具，也衍生出來劉如謙等人開發的先導編輯Prime Editor等。其中以CRISPR-Cas9技術為代表的基因編輯技術逐漸發展出了各種功能，例如：DNA剪切、轉錄激活（CRISPRa）、轉錄抑制（CRISPRi）、DNA甲基化和去甲基化、組蛋白修飾、DNA鹼基轉編輯等等。正如圖5所示，CRISPR-Cas9的多功能性就像一把分子生物學研究的「瑞士軍刀」促進了各項基礎科學研究。
圖5：CRISPR-Cas9多功能性圖示[3]
CRISPR基因編輯治療人類疾病
《Nature》雜誌曾評論說：「CRISPR基因編輯技術自問世以來，就一直被吹捧為治療疾病的遊戲規則改變者。」但要使這個夢想成為現實，最關鍵的就是如何將CRISPR-cas9工具成功導入人體，並保證其安全有效地編輯目標基因？
2021年6月，《NEJM》刊登的一篇文章：CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis，[4]該研究進行人體內基因編輯臨床試驗，使用脂質納米顆粒（LNP）遞送CRISPR-Cas9並靶向肝細胞，使其特異性沉默TTR基因，從而治療轉甲狀腺素澱粉樣變性病。（圖6）研究結果顯示，所有的參與者畸形蛋白質水平都下降，其中兩個接受了高劑量的蛋白質水平平均下降了87%。
圖6：CRISPR-Cas9治療轉甲狀腺素澱粉樣變性病
值得注意的是，這是首個體內 CRISPR 基因編輯療法的臨床試驗結果，大大擴展了 CRISPR 基因編輯療法的應用範圍，為許多遺傳疾病的治療開闢了新的途徑。
除此之外，使用CRISPR-Cas9技術治療艾滋病也成了眾多科研人員關注的研究方向。2019年，鄧宏魁研究組、陳虎研究組以及吳昊研究組合作在《NEJM》也報道了使用CRISPR-Cas9技術基因編輯修飾人成體造血幹細胞中CCR5基因，重建人體的造血系統。[5]
圖7：《NEJM》報道使用CRISPR-Cas9技術治療艾滋病和急性淋巴細胞白血病患者
該研究系全球首例利用CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯造血幹細胞並移植到艾滋病和急性淋巴細胞白血病患者體內進行治療，初步證明了基因編輯造血幹細胞在臨床應用中的可行性與安全性。
CRISPR技術在新發、突發傳染病領域的應用
隨著CRISPR基因編輯技術的不斷開發，在傳染病防治方面也展現了其卓越的性能。2019年10月，MIT和哈佛大學Broad研究所的Pardis C. Sabeti、張鋒等人在《Molecular Cell 》發表了一篇：Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13 的研究論文。[6]
該研究將Cas13的抗病毒活性用於RNA病毒檢測，建立了一個強大和快速可編程的診斷和抗病毒系統，命名為CARVER。之後，為應對突如其來的新冠肺炎疫情，張鋒實驗室開發的核酸檢測系統SHERLOCK實現了在1小時內檢測SARS-CoV-2。
圖8：將Cas13的抗病毒活性用於RNA病毒檢測
在艾滋病治療上，2022年6月發表在《Nature Biotechnology》上的一項研究，首次使用了CRISPR-Cas9技術針對小鼠體內的B細胞進行基因編輯，使其分泌靶向HIV病毒的廣譜中和抗體，從而達到治療艾滋病的目的。[7]
圖9：使用CRISPR-Cas9技術對B細胞基因編輯
該研究使用了兩個腺相關病毒載體（AAV）在體內工程化B細胞，其中一個編碼金黃色葡萄球菌Cas9（saCas9），另一個編碼一種抗HIV病毒的廣譜中和抗體3BNC117。當CRISPR導入B細胞後，便會引入該抗體基因。
小鼠實驗證明，B細胞可以在體內安全可靠地進行基因編輯。免疫接種後，基因編輯後的B細胞同樣經歷了抗原誘導的激活，並形成免疫記憶、克隆選擇以及分化為可分泌廣譜中和抗體的漿細胞。
CRISPR技術在農業和作物育種中的應用
在農業和作物育種領域，使用CRISPR-Cas技術提高作物產量、品質、抗病性和除草劑抗性、育種和加速馴化等方面依然有著廣泛且重要的應用。隨著測序技術的快速發展，越來越多植物物種的基因組信息變得可用，CRISPR-Cas基因編輯系統不僅幫助開發具有理想性狀的新品種，而且還徹底改變了當前的育種系統。[8]
與傳統育種方法不同，CRISPR Cas技術通過精確的基因組編輯，刪除導致不需要性狀的負面遺傳元素或引入功能獲得突變，提供了一種快速生成理想種質的方法。
例如：在眾多影響產量的因素中，調控細胞分裂素的動態平衡是提高穀物產量的可行途徑。編輯水稻細胞分裂素激活酶LOGL5的C端，可提高水稻在多種環境條件下的產量；
敲除編碼細胞分裂素氧化酶/脫氫酶(CKX)的基因，在小麥中產生高產表型；
通過敲除編碼氨基酸滲透酶3的基因，培育出了在保持稻米品質的同時提高分櫱數和產量的水稻品種。
CRISPR-Cas介導的其他基因編輯，包括O. sativa PIN5b(調節穗大小)、O. sativa GS3(調節粒大小)和Triticum aestivum GW2、O. sativa GW2和O. sativa GW5(調節粒重)，也使作物產量得到了增加。除穀物外，研究人員還通過基因編輯控制分生組織大小的CLV40和ENO41提高了水果作物的產量。
在抗病性研究上，與引入顯性抗性基因促進病原菌抗性的交互進化相比，利用CRISPR-Cas干擾寄主易感因子是保護植物免受生物脅迫的一種更有前景的方法。全球水稻生產受到細菌性疫病的嚴重威脅，這是一種由水稻黃單胞菌引起的毀滅性疾病。在感染過程中，一組細菌因子可以激活SWEET基因的轉錄，其產物是疾病易感性所需要的。利用CRISPR-Cas對O. sativa SWEET11、O. sativa SWEET13和O. sativa SWEET14啟動子區域進行突變，獲得了對X. oryzae pv具有廣譜抗性的水稻系。同樣，針對柑橘LOB1的啟動子區域，也同樣對柑橘黃單胞菌產生了抗性。
結語
儘管CRISPR-Cas基因編輯系統已經廣泛應用於生命科學和醫學領域的諸多方面，但是其存在的潛在局限，例如脫靶性也必須得到科研人員的重視。
此外，種系基因組編輯已經在動物和植物中得到廣泛使用，並且已經用於人類胚胎的研究目的。但是當應用於人類可遺傳基因組編輯時，正如國際科學組織所強調的那樣，賀建奎等使用人類胚胎編輯導致雙胞胎女嬰出生的報告也使得基因組編輯在人體應用上必須嚴格監管。
綜上所述，CRISPR-Cas技術的問世無疑促進了生命科學和醫學研究的發展，相信在接下來的時間裡，更多的功能和應用將會被科研人員發掘。
參考文獻
[1] Jinek, M., et al. (2012). "A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity." Science 337(6096): 816-821.
[2] 董樂,楊笑星,佟廣香,閆婷,孫志鵬,徐歡,劉天奇,匡友誼.CRISPR/Cas9基因編輯原理、發展及應用[J].水產學雜誌,2022,35(03):108-119.
[3] Doench, J. G. (2018). "Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens." Nature Reviews Genetics 19(2): 67-80.
[4] Rim, J. H., et al. (2021). "CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis." New England Journal of Medicine 385(18): 1722-1722.
[5] Xu, L., et al. (2019). "CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia." New England Journal of Medicine 381(13): 1240-1247.
[6] Freije, C. A., et al. (2019). "Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13." Molecular Cell 76(5): 826-+.
[7] Nahmad, A. D., et al. (2022). "In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice." Nature Biotechnology.
[8] Zhu, H. C., et al. (2020). "Applications of CRISPR-Cas in agriculture and plant biotechnology (vol 21, pg 661, 2020)." Nature Reviews Molecular Cell Biology 21(12): 782-782.
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