晚期非小細胞肺癌腫瘤異質性和微環境的單細胞分析

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題目：Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer期刊：Nature Communication（IF:12）日期：2021年5月DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-22801-0

總覽

肺癌是一種高度異質性的疾病。癌細胞和腫瘤微環境中的細胞共同決定了疾病的進展，以及對治療的反應或逃避。作者為了繪製晚期非小細胞肺癌 (NSCLC) 中癌細胞的細胞類型特異性轉錄組圖譜及其腫瘤微環境，通過單細胞 RNA 測序分析了來自 III/IV 期 NSCLC 患者的 42 個組織活檢樣本，呈現了晚期非小細胞肺癌的單細胞解析度條件下的情況。除了先前早期肺癌單細胞研究中描述的細胞類型外，作者還識別了腫瘤中的罕見細胞類型，如濾泡樹突細胞和 T 輔助 17 細胞。來自不同患者的腫瘤在細胞組成、染色體結構、發育軌跡、細胞間信號網路和表型優勢方面表現出很大的異質性。作者的研究還揭示了腫瘤異質性與腫瘤相關中性粒細胞的相關性，有助於闡明它們在 NSCLC 中的功能。

樣本信息

收集42名晚期（III/IV期）NSCLC的原發灶，癌症種類及是否吸煙等信息如圖。

單細胞測序技術

微流控晶元（具體見原文）

分析細胞數量

經過多個質量控制和過濾步驟，總共分析了 90,406 個細胞的轉錄組。

主要單細胞分析結果

晚期NSCLC細胞圖譜

左上圖顯示了鑒定出的細胞類型，包括癌細胞、髓系細胞、成纖維細胞、T細胞、B細胞、 中性粒細胞、肺泡細胞、上皮細胞、內皮細胞、肥大細胞以及濾泡樹突狀細胞。左下圖顯示不同患者的非腫瘤細胞傾向於聚類在一起，而癌細胞具有患者異質性。右邊兩張圖顯示了標誌基因熱圖以及細胞亞群所佔百分比。

肺鱗癌比肺腺癌具有更高的瘤間和瘤內異質性

42 名患者的CNA 譜顯示出患者間和患者內的異質性（a）。對於肺腺癌（LUAD）患者，在 7 號和 8q 號染色體中發現了顯著的臂水平插入，在 10 號染色體中發現了缺失。值得注意的是，具有已知驅動突變的肺腺癌在 1q 和 5p 臂中有額外的擴增。相比之下，肺鱗癌（LUSC）患者大多有 3q 插入和 5q 缺失。有趣的是，一些沒有驅動突變的肺腺癌患者具有與肺鱗癌相似的 CNA 譜。儘管癌細胞轉錄組的表達譜和組成在很大程度上是患者特異性的，但一些患者的癌細胞比其他患者更相似（b）。在大多數情況下，來自肺腺癌和肺鱗癌患者的癌細胞分成不同的簇。超過一半的肺腺癌患者聚集為一組，而大多數肺鱗癌腫瘤形成患者特異性簇，表明 LUSC 的腫瘤間差異高於肺腺癌。大多數患者，尤其是肺腺癌患者，例如 P16、P20 和 P32，具有顯性克隆，而在少數肺鱗癌（例如 P27 和 P37）中，惡性細胞擴散到多個簇中。

為了量化腫瘤內異質性，作者定義了基於 CNA 和基於表達的腫瘤內異質性評分，表示為 ITHCNA 和 ITHGEX。作者觀察到腫瘤內不同程度的異質性。ITHCNA 和 ITHGEX 顯示出中等相關性（圖d），可能是由於非驅動基因組改變或微環境形成的腫瘤表型。作者進一步根據癌症類型和突變將患者分為三組：具有驅動突變的 LUAD 患者（n = 12），表示為 LUADm，無驅動突變的 LUAD 患者（n = 6），表示為 LUADn，以及無驅動突變的 LUSC 患者突變（n = 16），表示為 LUSCn。有趣的是，與 LUADm 患者相比，LUSCn 患者具有顯著更高的 ITHCNA，而在 ITHGEX 方面沒有統計學意義（e）。這一發現還表明，具有驅動突變的患者可能會受到基因組改變以外的表型影響。

肺上皮細胞的可塑性及其向惡性腫瘤細胞的發育軌跡

這一部分是擬時序分析。所有鑒定的肺泡細胞均表達2型肺泡細胞 (AT2) 的典型標誌物 (CLDN18、SFTPA1、SFTPC)，但不表達1型肺泡細胞標誌物 (CAV1、AGER)。進一步的聚類分析揭示了兩個不同的 AT2 細胞簇，表示為 AT2-1和AT2-2（a）。AT2-2類似於正常的 AT2 表型，具有常見的 AT2 標記 SFTPA 和轉運蛋白 ABCA3 上調（b）。相比之下，AT2-1 表達細胞增殖和細胞遷移相關基因，如 CEACAM6、KITLG 和 FOXC1，暗示向惡性腫瘤的表型變化。上皮細胞可進一步分為纖毛上皮細胞、棒狀細胞和基底細胞（c、d）。

以前的研究表明，AT2 細胞和club細胞都可以發育成 LUAD 細胞，而基底細胞和club細胞是 LUSC的潛在祖細胞。因此，作者根據它們的發育軌跡組織了 AT2 細胞、俱樂部club細胞和 LUAD 癌細胞（e）。推斷的擬時間路徑顯示 AT2 細胞和club細胞獨立地轉變為 LUAD 腫瘤。相比之下，基底細胞似乎充當棒狀細胞和 LUSC 腫瘤細胞之間的過渡狀態（f）。除了這些不同的特徵外，我們發現一些患者的腫瘤細胞在分支的末端緊密聚集，這意味著同質和終末表型，而其他患者則具有更多樣和異質的特徵，沿著癌症發展軌跡擴散。

Th17 樣細胞及其與 Tregs 的潛在互變

在腫瘤浸潤性T細胞中，作者鑒定到了 CD4+ naïve T cells, CD4+ Tregs, CD4+ T helper 17-like T cells (Th17-like), CD8+ effector T cells, CD8+ exhausted T cells, 和Natural Killer (NK) cells （a），T細胞亞型通過基於先前研究的 T 亞型表達譜的監督細胞類型注釋確認（a）。為了進一步表徵兩個 NK 簇（CD3D-、KLRD1+、NKG7+），作者將 CD16+（FCGR3A）簇稱為 NK-1，將 CD16-簇稱為 NK-2（圖 4b）。NK-1 包含編碼上調的轉錄本fractalkine 受體 (CX3CR1) 和成纖維細胞生長因子結合蛋白 2 (FGFBP2)，兩者都參與淋巴細胞的細胞毒功能。NK-2 具有更高的組織駐留標誌物表達，如 CD49a (ITGA1)、CD103 (ITGAE) 和 ZNF683。包括 CTLA4 和 TIGIT 在內的共抑制免疫檢查點富含 CD4+ Treg 和 CD8+ 耗盡的 T 細胞（c）。然而，LAG3 主要在 CD8+ 耗竭的 T 細胞中表達，這與之前的研究結果一致。

然後，作者使用 Slingshot18 和 Monocle19 對 CD4+ T 細胞進行軌跡分析，以確定它們在 TME 內的發育途徑。Slingshot 揭示了 Tregs 和 Th17 樣細胞之間的過渡關係，起源於幼稚細胞（d）。Monocle 發現，幼稚細胞分化為兩個主要分支，Tregs 和增殖群體（e，f）。有趣的是，通過其主轉錄因子 RORC 的表達證實的 Th17 樣細胞顯示出沿從幼稚細胞到 Treg 的發育途徑傳播的過渡表型（f）。作者介紹，以 KLRB120 基因高表達為標誌的 CD4+ Th17 樣細胞群是通過 scRNA-seq 在 NSCLC 腫瘤環境中鑒定出的 Th17 樣細胞的第一份報告。文獻中有報道，天然 Tregs (nTregs)，Tregs 的一個子集，被認為與 Th17 樣細胞相互轉化。這一結果揭示了 Tregs 和 Th17 樣細胞之間複雜而微妙的相互作用，並強調了它們在對腫瘤抗原的適應性免疫反應中平衡的重要性。