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文 | 翟子
編輯 | 賀緒雲
前言
在製革業和鞣革廠中，大量廢棄物被處理掉，污染水、土壤和大氣，導致嚴重的人體健康問題。特別是製革業的化學脫毛過程產生了大量的有毒廢物。迫切需要使用無污染的替代工藝。由於羽毛中含有超過90％的角蛋白，希望開發使用角蛋白降解微生物的生物修復過程。
首先確定了可以產生角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌和假單胞菌。進行了優化，以最大限度地提高角蛋白酶的活性，包括培養溫度，pH和孵育時間。
還研究了金屬離子和各種底物對角蛋白酶活性的影響。結果表明兩種菌株的角蛋白酶活性在50°C時達到最大值，而B. cereus的最適pH為10.0，Pseudomonas sp.為7.0。
B. cereus的最高角蛋白酶活性為74.66 ± 1.52 U/mL，而Pseudomonas sp.為57.66 ± 2.52 U/mL。酶解脫毛效率也與化學脫毛進行了比較，經過粗角蛋白酶處理後，可實現完全脫毛。還進行了醋酸鹽沉澱的部分酶純化。在1L發酵罐中進行的B. cereus批量培養表明其是大規模角蛋白酶生產的潛在候選。
解決化學脫毛過程帶來的高污染難題
製革業和鞣革廠雖然涉及高度污染的過程，提供了多樣化的設施，用於生產能力以及出口潛力。製革過程需要多個步驟，包括脫毛、脫酸、軟化、脫脂，最後按照級聯方式進行酸洗，將原始皮革轉化為耐用的成品材料，適用於鞋、裙子、褲子、帽子、夾克、腰帶，以及書籍裝訂、傢具覆蓋等多種用途。
化學脫毛過程需要使用超過75種化學品，包括石灰和硫化物將原始皮革轉化為半成品皮革，這在製革業中產生了約90％的總污染，並且產生有毒氣體和固體廢物。
之前的報告估計，在製革過程中產生了近1000千克固體廢物中的近850千克，每處理1千克生皮/皮革需要使用約40至45升水。
這造成了許多困難，包括獲得良好水源，處理廢水以及脫毛過程中的硫化物排放。除了固體廢物，預鞣、鞣革和復鞣過程中的生化需氧量和化學需氧量，以及總溶解固體，幾乎佔了70％的污染。
微生物角蛋白酶的工業應用
角蛋白酶被歸類為蛋白酶，通過水解角蛋白，廣泛應用於製革、洗滌劑、紡織、醫藥、化妝品、肥料、廢物轉化以及藥物傳遞等多個行業。
角蛋白是脊椎動物上皮細胞中的一種不溶性結構蛋白，是皮膚及其附件的主要成分，具有很高的機械穩定性和對蛋白酶降解的抵抗性。羽毛中約佔91％的成分是角蛋白蛋白質，8％為水，1％為脂質，世界範圍內的家禽加工產業產生了大量的羽毛廢料。
家禽羽毛富含角蛋白蛋白質，不容易被常規的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶等降解，通過角蛋白降解微生物降解富含角蛋白的羽毛廢料對於去除羽毛廢料以及提供有價值的蛋白質至關重要，這些蛋白質可以用作動物飼料、農業和化妝品工業的營養添加劑，以及有機農業的氮肥。
角蛋白降解菌包括蠟樣芽孢桿菌屬，革蘭氏陰性菌，如假單胞菌屬。蠟樣芽孢桿菌屬的角蛋白酶因其對羽毛的降解效果而被廣泛研究。
角蛋白廢物的化學處理被認為是對環境的一種破壞性方式，對環境產生負面影響，因此高度希望考慮角蛋白酶的工業應用。使用粗角蛋白酶進行環境友好型的酶法脫毛，並將其與兩種傳統使用的化學品進行比較。
在搖瓶培養中，優化了反應條件，考慮了各種操作參數。還嘗試對粗角蛋白酶活性進行部分純化。還通過在1升發酵罐中進行批量培養，在優化條件下生產粗角蛋白酶，以展示其可能的工業應用。
角蛋白酶產量與特性研究
角蛋白酶產量在不同的培養條件下進行了優化，包括溫度、pH值、攪拌速度、孵育時間、接種量、底物以及碳源和氮源。通過研究細菌在不同溫度°下以及不同pH範圍進行72小時、84小時和96小時孵育的細菌生長情況，探究培養基溫度、pH值和攪拌速度對細菌生長和角蛋白酶活性的影響。
孵育後，將培養液離心於4°C，4000轉/分鐘，30分鐘，以測定角蛋白酶產量。在每種情況下，也測定了對照組，以比較相對角蛋白酶產量。
對粗角蛋白酶活性進行了部分特性鑒定，研究了不同的酶反應條件，如pH值、溫度、反應時間、底物和金屬離子，以尋找最佳的角蛋白酶活性。在pH值為4.0-11.0的條件下，通過使用乙酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、Tris-HCl緩衝液和碳酸氫鈉-氫氧化鈉來準備底物，測定了pH值對角蛋白酶活性的影響，並使用標準酶活性測定條件進行測量。
在50個土壤樣品中，根據產生透明圈區域的情況，發現了7株蛋白酶活性細菌。從中選擇了2株最佳角蛋白酶細菌。這可能是因為產生角蛋白酶的細菌也可以產生一個或多個其他特定的細菌蛋白酶，如鹼性蛋白酶、胰蛋白酶和胰蛋白酶。
為兩種角蛋白酶產生細菌進行了16S rDNA擴增PCR，其中提取的基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠上顯示出陽性帶，與DNA 1 kb標記相比。從16S rDNA序列比較推斷的同源性分析清楚地顯示，這兩株菌株分別與B. cereus和Pseudomonas sp.聚類，並在blast分析中具有100%的同一性。
所有結果都被提交到GenBank，其中B. cereus和Pseudomonas sp.分別被指定為MH430931和MH430929的進入號。BLAST相似性和系統發育分析表明，SA和SJ分離株分別被確認為B. cereus和Pseudomonas sp.。
微生物角蛋白酶產量優化與生物降解特性研究
B.cereus和Pseudomonas sp.的最佳生長速率分別在39°C和37°C的溫度下達到，這與對B. subtilis和Bacillus pumilis的其他研究結果一致50。培養基的pH影響反應混合物，並幫助營養物質通過細菌的細胞膜。
研究中，兩種角蛋白酶細菌在鹼性條件下表現出最佳的角蛋白酶產量。這種傾向是由於在角蛋白降解過程中，肽和氨基酸的脫氨作用導致氨的釋放，從而增加了pH。Gupta和Ramnani13也報道了在大多數微生物中，pH 6.0至9.0的鹼性pH支持角蛋白酶的產生。
較高的攪拌速率可以提供良好的細菌生長，但可能由於溶解氧濃度較高而導致角蛋白酶產量較低。另一方面，Pissuwan和Suntornsuk51報告，在低攪拌速率下，底物和細菌細胞沒有被充分混合，產生了異質形成，從而降低了溶解氧，導致了較低的角蛋白酶產量。
雖然羽毛降解可以在3至5天內完成，但它也需要超過5天的時間。Agrahari和Wadhwa52以及Yadav等53報道了Bacillus thurengenesis SN2和Bacillus菌株SAA5在第5天和第7天分別獲得最大的角蛋白酶產量。
B. cereus在96小時的孵育中使用雞毛羽獲得了最高的角蛋白酶產量，而Pseudomonas sp.在72小時的孵育中獲得了44.00±1.00 U/mL。
還測試了幾種接種量，發現3%的接種量對於B. cereus和Pseudomonas sp.的最高角蛋白酶產量負責。隨著接種量的進一步增加，酶的產量逐漸減少，這可能是由於細菌在生長早期迅速生長，消耗了必需的營養物質。Bacillus cereus和Pseudomonas sp.在羽毛粉中產生的角蛋白酶比原始羽毛高出2倍左右，人體頭髮作為底物也具有誘導性。
影響微生物角蛋白酶產生與特性的因素研究
碳源和氮源也影響角蛋白酶的產生，其中B cereus完全水解可溶性澱粉，而Pseudomonas sp.完全水解麥芽糖55。另一方面，乳糖對角蛋白酶的產生起到抑制作用。現酵母提取物提高了兩種細菌的角蛋白酶產量56，而硫酸銨起到抑制作用。在優化之後，額外的碳源和氮源對角蛋白酶的產生沒有刺激作用。
顯示了培養條件對角蛋白酶活性的影響，其中圖4A表明B. cereus和Pseudomonas sp.的角蛋白酶的最佳溫度為50°C，因為大多數角蛋白酶在50°C至60°C範圍內表現出熱活性。
B cereus LAU在50°C和pH 7.0的條件下顯示出最高的角蛋白酶活性，10,43而Microbacterium sp.的最大角蛋白酶活性出現在55°C和pH 7.0的條件下。B cereus的最佳角蛋白酶活性出現在pH 10.0，而Pseudomonas sp.在pH 7.0的條件下獲得最高的角蛋白酶活性。
在反應時間對胞外角蛋白酶酶活性的影響顯示，兩種菌株的最高酶活性在30分鐘時達到最高水平，將B. subtilis RSE163孵育在70°C下30分鐘可增強角蛋白酶活性。
研究了不同金屬離子的影響，與酶預先混合來研究它們對角蛋白酶活性的影響。Hg2+和Zn2+的抑制效應也被Kainoor和Naik56以及Lin和Yin58在Bacillus sp. JB 99和B. licheniformis YJ4的情況下所報道，與我們的研究結果是一致的。
角蛋白酶對複雜的蛋白質底物具有高效的水解作用，它在可溶性和不溶性底物方面具有廣泛的底物特異性。角蛋白酶可以高效地水解雞羽毛角蛋白，其次是酪蛋白、明膠和人體頭髮。得到了類似的發現，發現B. subtilis RSE163和B. pumilis KS12的最高角蛋白酶活性在雞羽毛底物上。
微生物角蛋白酶的性能研究
通過低里法對B cereus和Pseudomonas sp.的角蛋白酶進行了粗蛋白質的估計，分別為0.73和0.57 mg/mL，與BSA的標準濃度相比。Deivasigamani和Alagappan60以前報道過，角蛋白酶產生的微生物中大約含有1.44 mg/mL的粗蛋白質。
為了研究雞羽毛的降解率，在B. cereus的優化條件下進行了96小時的培養，而基礎培養基的pH和溫度分別為9.5和39°C，在96小時時發現最大的降解率為80%±0.025%。
嘗試觀察所產生的角蛋白酶酶在脫毛過程中與化學品的有效性，因為化學品會對皮革造成損害並降低其質量。將皮革片分別用酶和化學品浸泡總共16小時。在12小時後，使用酶實現了100%的脫毛效果，而化學品則導致皮革損壞。
16小時，Na2S對皮革造成了損害，而CaO的脫毛效果仍不完全。化學處理時，頭髮的纖維展現出粗糙的質地。來自B. cereus的粗角蛋白酶在12小時內獲得了最佳的皮革脫毛效果，研究中的B. cereus61、Pseudomonas stutzeri K4、B cereus AT49、Pseudomonas aeroginosa MCM B-32763和B. safenis64的脫毛過程分別需要24、20、18、16至21和16小時。
丙酮沉澱對細胞自由上清液中的粗角蛋白酶進行部分純化，去除其中的干擾元素。儘管丙酮是蛋白質的良好純化試劑，但由於其具有變性傾向，在純化過程中並不常用。對B. cereus和Pseudomonas sp.觀察到最大的特異性活性在70%和50%飽和度水平，分別具有約1.35倍和約1.67倍的純化倍數，這與Thangam和Rajkumar的報告不同。
除了燒瓶培養外，還進行了批量培養的大規模角蛋白酶生產研究，結果在培養4天後，角蛋白酶的產量為 U/mL，比燒瓶培養中的產量 U/mL增加了2倍。
結論
展示了B. cereus產生的角蛋白酶可以作為一種優秀的皮革脫毛劑，對皮革沒有不良影響，而化學品會產生有害效果。所提出的角蛋白酶對家禽廢料的降解不僅能夠更好地進行脫毛，而且能夠提高皮革的質量，相比化學品而言。
酶法脫毛減少了對孟加拉國鞣革業常用的有害化學品（硫化物、石灰和胺類）的依賴，從而減少了水、土壤和整體環境的污染，保護了人類健康和野生動物。
參考文獻
【1】張婧，《角蛋白酶的定向進化及其對羽毛降解特性的研究》，江南大學，2023年。
【2】蔣彪，《角蛋白酶產生菌的篩選、發酵優化、酶學特性及應用》，湖北工業大學，2017年。
【3】徐志龍，《產角蛋白酶菌株的分離篩選和羽毛粉固態發酵的初步研究》，華中農業大學，2018年。
【4】舒偉學，《角蛋白酶高產菌株的選育及其產酶研究》，西北農林科技大學，2017年。
【5】胡洪，《角蛋白酶基因工程菌的構建和表達及重組酶酶學性質與功效研究》，四川農業大學，2014年。
