文字/有范知識
編輯/有范知識
引言
體外培養的植物細胞的存在普遍的核不穩定性，這一現象在廣泛的植物材料中得到了證實—— 這種不穩定性通常表現為培養物染色體以及從中再生的植物染色體發生數量和結構上的改變。
筆者將利用細胞學技術，對野韭菜再生植株遺傳穩定性方面的有效性進行了實驗觀測，以驗證細胞學技術在確認再生植物遺傳穩定性方面的應用可行性和有效性。
一、野韭菜再生研究的緊迫性
野韭菜（蔥科）是花園洋蔥的重要野生近緣種，野韭菜中已知存在二倍體（2n=16）和四倍體（2n=32）細胞型，是非常具有研究價值的再生植株研究對象。
近年來，由於當地居民過度開採大蒜味的花序和葉子，缺乏有組織的種植，只採不種，導致具有重要經濟意義的物種的野生遺傳資源在自然棲息地中一直在減少，無法實現生物資源的可持續良性發展。
基於嚴峻的基因滅絕威脅，國家植物組織培養庫努力對這一重要物種以及其他相關類型進行體外保護。 隨後成功地完成了通過體外芽增殖的克隆繁殖，嘗試使用細胞學技術研究不同世代再生植物的遺傳穩定性。
通過再生細胞的細胞學研究表明，大部分(>90%)的細胞具有正常的補體，變異僅在一小部分細胞中發生，如瘤變、多倍體和結構改變。
與直接再生相比，這種結構和數值畸變的頻率非常高，在通過愈傷組織再生時表現得尤為突出。
不得不提的是，遷地保護為主要目標時，在直接再生和通過愈傷組織再生這兩種情況下，所有克隆增殖都應經常監測和驗證培養材料的基因組完整性。
除了生物化學、組織學和組織化學之外，細胞遺傳學分析是確定在再生和器官發生過程中核物質是否發生任何變化的最有信息和最可靠的技術之一。
在細胞遺傳學方面，核型研究最為重要，因為它們通常提供有關染色體結構、數量和總體形態的真實信息。
另一方面，減數分裂側重於染色體配對行為的細節、重組頻率的研究，更加關注染色體在後期 I階段 和 II 階段的分離模式，有絲分裂研究中不能直接推斷出來配對細節和重組頻率。
下面一起來了解野韭菜體外培育研究的試驗方法、觀測過程與結果分析。
二、體外再生植株研究的材料與方法
關於建立體外再生小植株的標準方案已在其他文章中討論過，在此不做贅述，下面詳細介紹本次實驗的材料與方法。
試驗對體內(對照)和體外(再生植株)材料都分別進行了核素學研究，包括四個連續傳代，分別標記為P1、P2、P3和P。
隨後在田間建立P（母本），培養傳代的植株，命名為P，(F)。為了確定核形態的變化，另外對體外培養的5個再生體進行了研究。
每個再生材料的根尖製備至少五張載玻片，平均每張載玻片上四個細胞組織，確保評分的數據偏差小於合理範圍。
為了進行減數分裂分析，同時從對照植株和P4(F)植株上採集適當大小的花蕾。
採集目標樣本：切除生長活躍的根尖(約1-2厘米)，在4℃雙蒸餾水中預處理24小時。預處理後的根尖在1:3冰醋酸:95%乙醇中固定過夜。然後將根尖保存在70乙醇中，溫度為10攝氏度，直至壓扁。
將花蕾直接固定在上述固定液中，並加入一滴FeCl3溶液，固定至少24小時，然後在溫度10攝氏度的70%乙醇中保存。
製備染色體：在3-4次蒸餾水中洗滌材料(根尖/花藥)，並在60攝氏度的鹽酸中水浴水解10分鐘。充分洗滌後，將水解後的材料轉移到淺色鹼性品紅溶液中，在室溫下黑暗保存約45分鐘。將染色材料用1%的乙醯胭脂紅壓碎，用ORWO MAB光負片從臨時製劑中拍攝顯微照片。
保存載玻片：用液氮冷凍技術去除蓋玻片，並使用1:3,1:6,1:9(冰醋酸:95%乙醇)系列脫水，然後用95%乙醇進行兩次變形，然後再裝在D.P.X.中。對於有絲分裂和減數分裂製備的分析，僅對具有良好扁平形態和可計數染色體的細胞進行評分。
三、不同對照組之間野韭菜細胞染色體數量和結構變化的觀察比照
3.1 染色體有絲分裂的補充觀察
對照植物根尖細胞中分析的大多數細胞的染色體數為32，但是其中遇到了一個特殊的、僅有30條染色體的單細胞異構體(2n=30)。
在P1、P2、P3中，正常染色體數目的細胞比例極高。
在P中，96%的細胞顯示正常染色體數目為2n=32，而其餘4%的細胞分別在3和1細胞中被發現為非整倍體或多倍體。
在P2和P3的情況下，正常細胞的比例被計算出來，明顯更高(表1)。對P2中遇到的三個異常細胞的臨界分析顯示，一個細胞發生了腺瘤，另外兩個細胞發生了一些結構變化，導致染色體形態明顯改變。
相反，P3植株的異常細胞(3)全部記錄為非整倍體。在田間轉移前分析的P4植株約有97%的正常細胞，而一小部分(3%)的細胞被觀察到異常。其中，2%記錄為非整倍體，1%記錄為結構改變(表1)
在野外條件下生長，對其次生髮育的根進行細胞學分析，顯示正常細胞數量較多(97.6%)。在2個細胞中表現為腺瘤(2n=31)，在1個細胞中表現為多倍體(>4倍)。
另外一個十分重要的發現則表明微核是核不穩定性的主要影響指標因素。微核染色體從未參與數值和/或結構改變，它們在大小和大體形態方面很好地保持了完整性。
在對照植物中，所有27個花粉母細胞(PMCs)在二倍體或中期I階段都有四價體、二價體和單價體的混合物，從所有單價體到上述組合(表2，圖7)。超過四價體水平的多價體完全不存在。
在pmc中觀察到的一個特徵是，與二價和單價相比，四價對手的出現比例極高。平均每個細胞有5.77IV+2.6211+3.621(表2)。
每個細胞的四分體數量在0-8之間(表4)。在分析的27個細胞中，多達8個細胞以所有四分體的形式存在關聯。
在四分體中，環型佔主導地位(平均=4.88;範圍=0-8)鏈條類型(0.88;0-4)(表2)。
這導致一些細胞只有環狀四分體，而鏈型完全不存在。類似地，在二價化合物的情況下，環形結構比棒狀(鏈狀)結構更經常遇到。
平均而言，每個細胞有2.18個環和0.44桿二價。雖然在少數細胞中可以觀察到多達12個環二價，但記錄到的桿二價最多只有兩個。
27個細胞中有3個細胞表現出失聯，並且在所有3個細胞中都遇到32個單價。
在田間轉移P4(F)的再生植株中，雙線/終枯期和中期I階段的染色體關聯非常有趣——他們在每個細胞不同關聯的平均值上表現出明顯的變化。
在分析的25個pmc中，除一份樣本有32個單價外，其他所有的pmc都顯示出不同比例的四價、二價和單價，平均每個細胞有5.40IV、4.56II和1.4I。
對這份材料的對比發現，也像對照植物一樣，在所有分析的細胞中都沒有觀察到超過四聯體水平的關聯。
在四價和二價的情況下，環型和鏈/桿型結合的比例的相對差異遵循與對照植物中觀察到的趨勢相似(表2)。
範圍=0 ~ 8)的鏈類型(0.96;0 ~ 2)、環二價(3.68;0-9)的發生率高於二價棒(0.8;0.5)。
在P4(F)植物中觀察到的另一個有趣的特徵是每個細胞的四分位元數在0-8之間(表4)，與對照組29.6%的細胞相比，分析的20%的細胞具有所有四分位元。
3.2 不同組別之間染色體出現交叉頻率的組合分析
對照組平均每個PMC的染色體交叉頻率為28.88，其中有22.70個被終止，終止係數為0.79(表3)，而P，(F)植物的染色體交叉頻率和被終止的染色體交叉數量略有增加。
根據計算得出，每個細胞平均交叉數為30.56個，其中25.28個被終止，在塊莖連翹對照和再生植株的pmc中，終止係數為0.84(表3)(表2續)
在對照植物中，在後期I觀察到的20個細胞中，有13個呈正態分布(16:16)(表5)。其餘的細胞呈不均勻分布和/或一系列異常現象，如滯後/滯後的二價體和染色體的延遲分離。
P，(F)與對照的不同之處在於，P，(F)具有更多的(75%)染色體正態分布的細胞，其餘25%的細胞呈不均勻分布或具有上述的一些異常(表5)。
兩個細胞在後期II顯示了編號為2的微核的存在，而一些細胞除了正態分布外，還顯示了染色體的滯後和/或晚期分離。
對照植株有75.06%的可染色花粉，而P，(F)植株有73.07%的可染色花粉(表5)。
四、分析與討論
染色體的不穩定性是體外培養系統及其再生植株的相關現象，許多研究者已經通過根尖的核學研究證明了細胞核的不穩定現象時有發生，而關於減數分裂期間染色體穩定性和配對行為的報道則較少。
我們對有絲分裂和減數分裂兩個方面進行了研究，主要目的是監測通過組織培養再生的植物的遺傳穩定性，不僅包括培養傳代期間，也將觀測時長拉長到其野外建立後。
對於一般的各種蔥屬植物，特別是野韭菜，無論是從染色體數目、大小、形態、配對行為及其分離模式等方面都鮮有報道，因此我們的實驗是在這個方向上的第一次嘗試。
如前所述，二倍體和四倍體細胞型在自然界是廣泛存在的。
在對照植物的根尖細胞中，絕大多數(99.2%)的多倍體互補體(2n=32)的出現證實了本研究中使用的材料是四倍體細胞型。
一個2n=30的異常細胞通常與倍體水平或8作為基本染色體數目的有效性沒有任何關係。
減數分裂分析顯示29.6%的pmc中有8個四聯體，而Mathur和Tandon的學術報道中宣稱有16個。
由此可見，在多倍體類群中，這種染色體數目不正常的小比例染色體是自然存在的。
由表1可以清楚地看出，各代(P1、P2、P3、P4)的再生細胞，即使在田間建立後，也不受培養時間延長的影響，保持原有染色體數目(2n=32)。
更有趣的是，畸變的數量和核型只在一小部分細胞中出現。
這些觀察數據表明，培養的外植體(莖基)含有大部分均質細胞，這些細胞能夠形成不定芽並再生出具有穩定基因型的植株。
在1 ~ 18個月大的野韭菜四倍體細胞型中我們觀察到了如非整倍體、三極性和微核等的染色體異常。
與此相反，這種畸變在一個二倍體類群a. cepa的愈傷組織培養物中則很少出現。
基於這種觀察結果，我們可以得出結論，外植體材料的倍性水平確實影響染色體異常的範圍和頻率。
儘管外植體材料是四倍體，但再生體由於沒有間接性愈傷組織，在連續幾代中保持了染色體數目和結構的完整性，即使有異常，也僅限於非常小比例的細胞。
在多倍體物種，尤其是自四倍體物種中，無論是自然發生還是人工培育，四價平均降低和相應的二價頻率增加在連續幾代中是很常見的，並且在許多植物組織培養的相關研究材料中都有記載，如油菜、馬鞭草、莧屬植物、竹節蘭和毛豆屬植物。
這種現象經常導致「二倍體」，這反過來又幫助植物適應新的物理和生理環境。雖然很難進行一對一的比較，但在P4(F)植物中觀察到的趨勢與此高度相似。
表2中關於對照和P4(F)植物中四價和二價的平均值的數據顯示前者顯著下降(從5.77下降到5.40)，並且在二價情況下增加了約57.5%(從對照的2.62上升到P4(F)的4.56)。
由此可以清楚地證明，P4(F)植株存在二倍體現象，儘管程度較輕，但和對照組比起來，再生植株中較小比例的單價似乎間接促進了二倍體化過程。
多價和三價的完全缺失進一步證實了這一點，三價和多價是唯一的其他可能的構型。P4(F)植物的交叉頻率較高，表明材料的基因組成可能存在更多的重組。然而，更多的染色體交叉被終止，使得終止係數的值更大。
對照植物的相應值分別為28.88和0.79(表2)，在P，(F)植物的後期I染色體平均分布細胞百分比的邊際增加(16:16)可能與每個細胞的二價平均增加直接相關，與多價構型相比，通常傾向於以一種更有序的方式分離。
這主要是由於中期I二價的構型簡單和合適的取向。正常減數分裂的再生植株(P，(F))花粉著色率低，表明後者不是由於任何染色體的因素。
至此我們可以大膽地總結：基因和生理因素的參與也許發揮了至關重要的作用。
總結
筆者通過利用細胞學技術，對野韭菜再生植株在4代培養和田間建立後的遺傳穩定性進行了研究。
再生細胞的核學研究表明，目前的研究發現中大部分(>90%)的細胞具有正常的補體和變異僅局限於一小部分細胞，如瘤變、多倍體和結構改變。
再生植株的減數分裂分析表明，它們大體上與對照植株沒有差異，所有參數(關聯，交叉頻率，終端係數和花粉著色性)與對照植株相比沒有顯著變化。
四價範圍和頻率顯示再生植物的相當大的減少，進一步證實了細胞學技術在確認再生植物遺傳穩定性方面的有效性。
參考文獻
郭仰東，《用組培方法繁殖韭菜雄性不育無性系的研究簡報》
楊賀，《植物細胞工程應用及發展前景》
馬樹彬，《中國韭菜雄性不育系的選育與應用》
張憲省,《韭菜可育和不育花藥和花粉發育的細胞學觀察》
荊紹凌，《細胞工程在玉米種質改良中的應用》
利容千，《韭菜不同品種的核型分析》
