疫苗的安全性要求非常高，因為它們是用於健康人的。因此，疫苗開發既耗時又非常昂貴。縮短上市時間對於製藥公司來說是關鍵，可以挽救生命，並節省金錢。因此，需要系統的、通用的和有效的工藝開發策略來縮短開發時間並增強對工藝的理解。高通量技術極大地增加了與工藝相關的有用數據量，結合統計和機械建模，新的高通量工藝開發(HTPD) 方法不斷發展。引入基於模型的 HTPD 可以更快、更廣泛地篩選條件，並進一步增加知識。基於模型的 HTPD 對於層析法尤其重要，而後者是獲得高純度的關鍵分離技術。
本綜述將介紹生物製藥行業中使用的下游工藝開發策略和工具，重點關注疫苗純化工藝。隨後將根據實驗工作和理解，對高通量工藝開發和其它組合方法進行討論和比較。在不斷增長的信息海洋中，新型建模工具和人工智慧(AI) 對於發現數據背後的模式並因此獲得更深入的工藝理解變得越來越重要。
[以疫苗為例，回顧加速純化工藝開發的最新策略進展]
下游工藝開發方法
工藝開發的總體目標是設計最佳的純化工藝，通過以最小的成本和時間，努力實現純度目標，同時遵守所有法規要求。目前，疫苗開發主要採用基於DoE 的方法，但它也可以受益於更先進的、基於模型的工藝開發方法，這些方法已經用於其它生物製藥領域，例如mAb 的純化。圖 3 顯示了兩種類型的工藝開發方法，基於 DoE 的方法和基於建模的方法。在下文中，將簡要介紹工藝開發方法。
圖3. 兩種不同工藝開發方法概述。左:實驗設計(DoE)方法，基於統計工具進行實驗，並通過統計分析評估結果。這種方法通常應用於生物製藥行業。右:基於模型的工藝開發方法，通過有針對性的實驗確定模型輸入參數，如等溫線參數和柱參數。在執行優化之前，必須對模型進行驗證。
實驗驅動的下游工藝開發
一次一個因素（OFAT）和實驗設計（DOE）
一次一個因素 (OFAT) 是一種更傳統的方法，其中一個因素在一系列實驗期間發生變化，而其它因素保持不變。在這種方法中，因素之間的依賴關係被忽略了，因此發現最優值相當困難且效率很低。出於這個原因，十多年前，生物製藥行業轉向基於統計的DoE 方法來設計和分析實驗，從而通過減少實驗獲得更多有價值的信息。經典的DoE 方法是因子設計。對所有可能的因素組合進行實驗，目的是確定每個因素的影響以及因素之間的相互作用對響應的影響。對經典DoE 篩選的改進是確定性篩選設計，它估計曲率效應並能夠將對響應具有顯著影響的因素與具有可忽略不計影響的因素區分開來。提供三級多因素設計的其它方法是Box-Behnken 或中心複合設計。Hibbert D.B.深入介紹了最常用的 DoE 方法，重點是層析。現在有各種DoE 軟體，如 Design-Expert、Modde 和JMP，但其它統計軟體，如 R、SPSS 和各種Python 軟體包，也可用於 DoE 目的。
針對建模目的的數據獲取
另一種實驗策略是確定作為機械或物理模型輸入的參數。機械模型的使用已在幾十年前建立，如今已被化學工業廣泛採用，其中一些工藝甚至完全在計算機上設計。直到最近，生物製藥和疫苗行業才在其工藝開發中啟動了這一策略，其中主要挑戰通常是複雜的進樣混合物，其中包含目的產品（例如抗原）以及數千種蛋白質和雜質。這可能就是為什麼機械建模和參數採集尚未被廣泛採用的原因，因為幾乎不可能通過實驗確定和模擬數千種蛋白質和雜質。然而，HTE使確定模型參數非常值得，即使對於更複雜的混合物。值得注意的是，經過驗證的模型增加了對工藝的理解，並能夠優化計算機中的工藝，從而節省時間、材料和成本。對於層析目的，由於這是蛋白質亞單位疫苗中的主要純化技術，描述組分與固相結合行為的吸附等溫線參數至關重要。吸附平衡的實驗測定是建立等溫線參數所必需的，可以通過批量吸附實驗、正面分析、等度洗脫或線性梯度洗脫或利用逆技術獲取，通過調整某些參數來最小化實驗和模擬洗脫曲線之間的差異。除了等溫線測定外，還必須獲得層析柱和填料的特性才能獲得經過驗證的模型，但是這些更容易獲得。
高通量篩選
大約二十年前，液體處理站 (LHS) 的引入加速了實驗的執行，也稱為高通量實驗（THE） 或高通量篩選（HTS）。由於自動化、微型化和並行化，創建大型數據集變得可行，同時允許更短的時間內使用更少的樣本量和資源。自動化的另一個好處是降低了可變性，並提供卓越的精度。如今，LHS已成為學術界和工業界廣泛應用的技術，可顯著縮短工藝開發時間。由於LHS 允許篩選更多條件，因此為純化工藝找到最佳條件更為可行。除了系統的好處之外，文獻也報道了一些缺點。例如，LHS在準確模擬工藝柱的液流分布方面存在局限性。HTS 需要對有效的實驗設計有高度的理解，以便最佳地利用系統，因此它更像是一種工具，而不是一種單獨的方法。
專業知識驅動的下游工藝開發
一般經驗
經驗法則、現有工藝的可用知識和經驗是設計新生產工藝的專業知識或啟發式方法的基礎。專業見解很容易應用，並且可以通過消除結果不太理想的單元操作的組合來加速工藝設計。Asenjo等人開發了一個專註於下游蛋白質工藝的專業系統；該軟體使用由通用工藝設計（啟發式）專業知識組成的資料庫來支持和加速選擇一系列單元操作的決策。一些手冊也廣泛地概述了一般設計啟發式。大多數疫苗純化工藝也基於啟發式方法，例如從哺乳動物細胞培養中純化甲型肝炎病毒，其中第一步涉及低成本陰離子交換層析法，以捕獲產物並去除大量雜質，下游工藝的最後步驟是使用尺寸排阻層析法的精純和脫鹽步驟。一個幾乎完全基於知識的一般示例是平台工藝，將在下一段中更詳細地解釋。
平台工藝
平台工藝可用作「模板」，利用預先建立的一系列單元操作，針對特定類型的分子設計整個純化序列。平台說明提供了每個單元操作的操作條件的詳細信息，對應於整個純化流程。關鍵優勢之一是減少了類似分子的工藝開發時間、相關監管和資源要求，從而降低了上市時間和驗證工作。此外，平台文件不僅可以在不同部門之間共享和匹配，還可以在不同的生產站點之間共享和匹配，成為一個無關站點的工藝。平台工藝方法最適合具有相似特徵、繼而相似純化步驟的生物製藥。例如，mAb的定義相對明確，平台工藝可用於為新的mAb 異構體建立類似的純化流程。有關工藝相關污染物的詳細信息，例如HCP 和相應細胞培養的其它雜質，即 CHO 和雜交瘤細胞，是已知的。純化步驟的順序包括Protein A 層析、低 pH 病毒滅活、IEX層析精純步驟、除病毒過濾以及超濾/洗濾。只需對純化工藝條件進行微小更改即可確定新的 mAb 異構體的純化工藝。平台方法的其它潛在適用候選產品可能是 pDNA 疫苗和流感疫苗，其均具有相似的特性和純化步驟。然而，mAb的性質相對相似，而蛋白質亞單位疫苗的表觀差異很大，使得純化工藝更加難以標準化。
基於模型的下游工藝開發
在工藝工程中，模型發揮著重要作用，它們旨在以抽象的數學形式表示一個真實的系統。Bézivin和 Gerbé 將模型定義為「以預期目標構建的系統的簡化。該模型應該能夠代替實際系統回答問題」。與工藝工程相關的預期目標可以是控制、模擬、設計、監控或優化。根據目標，可能有不同的模型適用。模型有助於理解複雜的問題，並且如果模型能夠充分表示建模系統的目標特徵，則可以提供潛在的解決方案。使用給定的一組參數運行模型即為模擬，是一種運行虛擬實驗的廉價且安全的方法。因此，可以減少和/或更有效地設計實驗室中的實驗次數，從而減少時間和材料消耗。儘管使用模型聽起來很有吸引力且很有前景，但開發能夠實現預期目的的合理模型需要時間、精力和知識。此外，該領域缺乏能夠開發、維護科學和工程軟體的人員。在不久的將來，預計會有更多的工藝工程師或科學家會熟悉建模，因為現在大多數技術相關研究都提供編程和數據處理課程。為了建立一個模型，兩個主要資源是必不可少的，即工藝知識，轉化為自然規律，以及從真實系統中獲得的數據的收集。在工藝工程中，可以區分第一原理、機械或知識驅動模型和數據驅動或經驗模型，分別稱為透明白盒模型和不太透明的黑盒模型。兩者的組合稱為混合半參數模型。表 1概述了主要優點和缺點。
數據驅動的模型
數據驅動或經驗模型試圖根據預定義設計空間內的觀察實驗來描述輸入-輸出關係，例如人工神經網路 (ANN)、統計和回歸模型。生物製藥行業經常使用統計模型，通過使用DoE 和適當的統計數據分析方法（例如響應面方法(RSM)）執行一組預定義的實驗，或者通過使用現有數據集進行多元數據分析。RSM 是一個眾所周知的經驗模型，它描述了DoE 內不同測試因素之間的響應關係，並生成了一個描述數學關係的模型。該統計（黑盒）模型僅觀察因素與響應的相關性，而沒有獲得對估計參數的基本機械（物理化學）理解。通過一階和二階多項式利用DoE 和回歸分析，可以估計最佳輸入組合。然而，將數據擬合到二階多項式是RSM 的一個主要缺點，因為通常並非系統內的所有曲率都可以用二階多項式來描述。DoE與經驗模型相結合已廣泛應用於生物製藥行業和學術界的下游純化工藝設計。有研究人員使用DoE 和線性回歸模型研究了高鹽溶液對 RNA 沉澱和 pDNA 回收的影響。最近，Chiang等人利用 DoE，評估了在從單柱操作切換到多柱操作時，層析參數對病毒清除的影響。數據驅動模型的一個主要限制是它們僅在測量變數的定義區域內有效，並且只能預測該區域內的變數，這使得外推通常非常不準確。此外，可以提取的工藝知識很少，因為參數通常只是相關性。另一方面，與機械建模相比，數據驅動建模不需要提前了解工藝，並且耗時更少。
機械建模
機械、第一原理的或知識驅動的模型試圖根據有關工藝的知識來描述工藝或系統中發生的內部機制和現象。這些模型由物料和/或能量平衡以及傳輸和熱力學現象組成，並具有固定的結構，這意味著參數可能具有物理解釋。模型參數由實驗數據或物理相關性估計。純化過程中發生的物理過程可以轉化為數學模擬模型。一個經過驗證的機械模型允許在計算機中探索各種條件，因此能夠有效地獲得最佳操作條件。層析柱內發生的現象在文獻中有很好的描述，Ruthven已經深入介紹了動力學和吸附過程。動力學或速率模型在實踐中最常見，包括分散因素，如傳質和分散效應，以及平衡因素，如吸附等溫線、離子解離和分子間締合。三個最突出的動力學模型是集中動力學模型、集中孔隙模型和一般速率模型，它們按複雜程度排列。這些模型的主要區別在於覆蓋孔隙擴散效應的程度。然而，其適用於所有力學模型，等溫線參數至關重要，如前文所述，其中存在許多結合模型，例如線性、Langmuir、空間質量作用和混合模式。層析模型的使用範圍從工藝合成、優化和控制到放大、填料選擇和穩健性研究。進一步的步驟是模擬集成式層析和其它調節步驟的組合，以找到最佳整體純化工藝。目前已有多種層析機械模型的商業化軟體可供使用，例如：GoSilico（Cytivia子公司，正式名稱為ChromX）、Aspen Chromatography、DelftChrom、CADET和ChromaTech。
用於吸附實驗的計算機替代方法已經研究了幾年。分子動力學模擬試圖在詳細的原子水平上描述填料-蛋白質之間的相互作用。定量構效關係 (QSAR) 將分子特性與經驗模型相結合，以發現保留行為和蛋白質表面特性之間的相關性。這種分子模型可用於預測蛋白質在填料上的保留行為，以減少工藝開發時間。然而，通常需要關於每個成分的詳細信息，例如氨基酸序列或晶體結構，並且還需要大量的實驗。
與數據驅動模型相比，機械模型可以探索更寬範圍甚至超出觀察到的測量結果的條件，具有更高的外推能力。這有助於工藝理解，符合QbD 倡議，儘管機械建模也需要物理理解。基於知識的模型的主要缺點是它們的複雜性，因此與數據驅動模型相比需要更多的開發時間。
混合（半參數）建模
混合（半參數）建模將參數（即基於第一原理、機械和知識的模型）與非參數（即數據驅動模型）相結合，以消除個別方法的缺點並充分利用兩者。Von Stosch等人廣泛回顧了混合半參數建模框架和生物化學工程中有關過程監測、控制、優化、模型縮減和放大的各種應用。參數和非參數模型可以串聯或並聯配置，具體取決於模型的範圍。當機械（白盒）模型性能有限或不夠準確時，通常建議使用並行模式，並且添加非參數（黑盒）模型可能會改善評估，如圖4c。串列方法通常用於通過使用非參數模型確定參數來降低機械模型的複雜性，如圖4a，或者當機械模型的結果作為非參數模型的輸入時，如圖4b。
圖4. 混合建模配置，白盒表示機械/第一原理模型，黑盒表示數據驅動模型。串列方法 (A, B) 和並行方法(C)。
混合建模的有用性在於它能夠經濟高效地解決複雜問題並開發模型。除了獲得更廣泛的工藝理解外，其它優點還包括優化的模型精度、透明度和外推特性。然而，挑戰在於了解以何種方式可以組合不同類型的模型來開發混合模型。因此，需要對數據驅動模型和機械模型有透徹的了解，以及獲取正確數據的知識。混合建模越來越受到工業界和學術界的關注，並且似乎是克服數據驅動和機械模型缺陷的一種很有前途的方法。
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原文：D.Keulen, G.Geldhof, O.L.Bussy, et al., Recent advances to accelerate purification process development: a review with a focus on vaccines. Journal of Chromatography A, 2022, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2022.463195.
