MALDI-TOF MS 在微生物鑒定中的重要應用及挑戰

來源：小桔燈網

作者：quite

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS) 是應用於臨床微生物檢驗領域的一種新技術。這一技術的出現為準確地鑒定細菌、真菌和分枝桿菌提供了良好的工具。歐洲微生物實驗室首先開始使用MALDI-TOF MS。由於其簡便、高準確性、快速周轉時間和低成本等優點，使得該技術在全球微生物實驗室被廣泛採用。得益於質譜技術在微生物鑒定方面的飛速發展，國內研究學者們也逐漸重視MALDI-TOF MS在微生物領域的應用。

歷史和發展

雖然在1975年已首次提出將質譜用於細菌鑒定，然而當時採用的電離方法會使蛋白質片段化，所以阻礙了其有效分析的能力。20世紀80年代，有兩個團隊提出了類似的想法來檢測完整的大分子，一起發明了用MS研究完整田中耕一(Koichi Tanaka) 及蛋白質的技術。其同事發明了一種使用混有甘油的超細金屬粉末來分析生物大分子且同時不破壞大分子的方法。為此，田中耕一被授予諾貝爾化學獎(與John Fenn和Kurt Wiith rich共享) [2]田中耕一發表研究的同時， Franz Hillen kamp和Michael Karas發表了使用有機化合物基質煙酸進行軟解吸電離來分析生物大分子的研究[3]基質輔助激光解吸電離(matrix-assisted laser desorption MALDI) 這一術語亦來源於此。2006年，Fox在Journal of Clinical Microbiology上發表了第一篇有關質譜技術在臨床微生物應用的文章，引起同行關注，他認為該技術鑒定細菌還有許多技術難題要克服，不易成為常規方法，但是2009年後微生物質譜技術迅速風靡歐洲、北美和亞洲的一些國家。基質輔助激光解吸電離離子源和飛行時間質量分析器質譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技術吻合了微生物專家的期待：操作簡單、鑒定迅速、低運行成本及自動更新的資料庫。在微需氧菌、厭氧菌、真菌及分枝桿菌等難培養微生物鑒定方面表現尤為突出，鑒定時間由數天推進到以分鐘和秒計算。新開發項目更是令人鼓舞，如無菌體液的直接鑒定、耐葯表型識別、致病毒素分析以及醫院感染病原體遺傳溯源等。

相關國標與指南

行業內的朋友們都知道，質譜在臨床領域的一大問題就是缺乏標準化和規範化。但是MALDI TOF MS相對而言其標準和共識還是比較全面的。

國標 《GB/T 33682-2017 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜鑒別微生物方法通則》

《MALDI-TOF MS病原體鑒定質量保證專家共識》

《MALDI⁃TOF MS在臨床微生物鑒定中的標準化操作專家共識》

《臨床微生物學實驗室建設基本要求專家共識》

《中國核酸質譜應用專家共識》

《中國臨床微生物質譜應用專家共識》

《自建MALDI-TOF MS微生物鑒定資料庫專家共識》

待發布衛生標準 《臨床微生物檢驗基本技術要求》

臨床應用

耐藥性檢測

微生物實驗室不但要提供精確的病原菌鑒定結果，同時還要檢測其敏感性，為臨床醫生提供治療依據。常規的藥物敏感性試驗方法比較費時， 一些酶聯免疫、凝集等方法只能局限於少數細菌。MALDI-TOF MS可為耐葯基因檢測提供一個很好的平台，可以分析幾乎所有的耐葯機制，目前報道的方法主要基於下列幾種原理：分析抗菌藥物及被修飾後的產物；分析細胞組分；分析核糖體DNA甲基化；檢測突變等。

流行病學

微生物實驗室、感染控制人員和臨床醫師面臨的挑戰之一是在某個臨床菌株暴發流行時可以得到菌株代表分類的特異數據，如沙門菌、鏈球菌等，為了準確得到血清型、亞型或其它分類，實驗室必須耗費更多的時間做進一步檢測，而且許多菌株分型需要特殊的試驗方法、儀器、耗材等。因此，條件有限的實驗室就需要外送做檢測，可能導致檢測時間延長、丟失重要的流行病學數據、增加檢測費用、結果不準確等。但如果在微生物實驗室內快速、準確完成重要數據的結果將會幫助臨床醫師、護士、感控人員和衛生機構處理、追蹤感染病原菌並掌握其流行狀況。

目前，通過大量菌株的群、屬、種分析，以及許多菌株分型研究的深入，MALDI-TOF MS所具備的鑒定這些高度相關菌株的能力將使臨床微生物實驗室的影響力提升。將來可能出現更加精密的MALDI-TOF MS儀器，不但可以鑒定病原菌，同時可以快速、準確地提供菌株的流行病學數據，這將使臨床微生物實驗室在醫院感染控制、病原菌暴發、耐葯菌國家監測及生物防禦等領域扮演重要角色。

常見細菌的鑒定

常規微生物鑒定主要基於生化反應、顯微鏡檢、免疫學或者分子生物學。這些分析方法專業知識要求較高，並且費時費力。等待結果期間臨床醫師會經驗性使用抗菌藥物，然而有時是不合適或者錯誤的。現代臨床微生物實驗室需要快速、可靠和經濟的方法來鑒定細菌，以便及早進行適當的抗菌藥物治療。質譜技術將微生物鑒定從24~48h縮短到數分鐘，而且僅需分析極少的菌量（104~106 CFU/mL）。以16SrRNA基因測序結果為標準，質譜儀正確鑒定率為90.0%~95.0%，遠高於以往的商業自動化鑒定系統。

獲NMPA認證的企業一覽

近幾年，國內在MALDI-TOF MS儀器的研發與生產快速起步，湧現了一批科研人員和企業，大大推動了MALDI-TOF MS國產化的進程。MALDI-TOF MS將可能成為首個由中國企業掌握最領先核心技術，並引領技術發展的質譜儀品類，這對我國在生物大分子分析研究、臨床分子診斷應用等方面有極大的推動。由數據可看到，2020年到現在新獲批的國產飛行時間質譜達9家。

挑戰

質譜鑒定的準確性依賴於菌種資料庫的質量，菌種資料庫信息不全將會限制鑒定準確性，豐富菌種資料庫將有利於鑒定結果的準確性。雖然自建資料庫可以提高鑒定率，但是耗時，需要專業技術人員及真菌學專家指導。此外，體外診斷認證的資料庫並不允許隨意增加，因此只能用於科研。其次，雖然MALDI-TOF MS能快速有效地鑒定細菌，但其對後續的抗菌藥物敏感試驗的指導意義還存在諸多爭議。

儘管MALDI-TOF MS所得到的結果一般是可重複的，但也有變化的可能。質譜儀（不同類型及單個儀器、儀器年齡、儀器配置）、基質和溶劑組成、製備方法、技術人員培訓和能力、培養條件（如培養基、菌株培養的時間和溫度）和生物學變異都可能影響其結果。所以，其規範化質量控制策略仍需要被制定。另外，分離好的菌落必須經過檢測，如果菌落沒有很好地被分離，則有可能有多種微生物存在，而佔比少的菌種可能不被發現。

引用：

[1] FoxA. Mass spectrometry for species or strain identification after culture or without culture: past, present, and future[J]. J Clin Microbiol, 2006,44:2677-2680.

[2] 曹書娟, 劉彬, 朱安娜. MALDI-TOF MS在藥物基因組學檢測中的應用及展望[J]. 分子診斷與治療雜誌, 2020, v.12;No.65(01):121-125.

[3] 羅燕萍. 質譜技術在臨床微生物實驗室中的應用前景[J]. 檢驗醫學, 2015(2):97-101.

[4] 田月如, 關明, 李敏. MALDI-TOF MS技術在臨床微生物診斷應用中的挑戰[J]. 中華檢驗醫學雜誌, 2018(8):559-562.