类胡萝卜素是不可缺少的植物次生代谢产物，参与光合作用、抗氧化和植物激素生物合成。类胡萝卜素可能参与其他尚未发现的生物学功能。在这项研究中，我们整合了基因组、生化和细胞研究，以深入了解柑橘愈伤组织过表达 CrtB（来自泛托亚附聚体的八氢番茄红素合酶）中类胡萝卜素相关的生物过程。
转录组学分析为类胡萝卜素相关的氧化还原状态、淀粉代谢和类黄酮/花青素积累的生物学过程提供了深入的见解。通过应用生化和细胞学分析，我们确定改变的氧化还原状态与O的变化有关2 -和 H2O2水平。我们还确定富含类胡萝卜素的愈伤组织中淀粉积累的减少。此外，研究富含花青素的马齿苋愈伤组织表明类胡萝卜素对花青素积累有负面影响。
类胡萝卜素在1多亿年前首次出现在细菌中，属于所有生物中常见的异戊二烯亚科。在自然界中，类胡萝卜素起源于香叶基香叶基焦磷酸盐（GGPP）的缩合反应，该焦磷酸酯是通过质体定位的4-C-甲基-D-赤藓糖醇2-磷酸（MEP）途径合成异戊二烯前体。
在关键的速率控制步骤中，八氢番茄红素合酶（PSY）介导GGPP的缩合，形成第一个类胡萝卜素八氢番茄红素。随后，通过各种合成途径产生不同类型的类胡萝卜素，包括去饱和、异构化、环化、羟基化和其他修饰。
类胡萝卜素及其衍生物起着重要的生理和生态作用。它们参与植物生长、发育和繁殖中的光合装置、光保护色素、抗氧化剂、激素前体和传粉媒介引诱剂。类胡萝卜素是植物激素的前体，如脱落酸、独脚内酯和最近发现的羧内酯，可负调节植物腋窝生长。拉梅尔等人最近发现，源自β-胡萝卜素和活性氧（ROS）之间反应的类胡萝卜素内过氧化物可以作为应激信号，介导拟南芥中单线态氧的基因反应。
此外，在类胡萝卜素工程马铃薯块茎中观察到对内源性致胡萝卜素基因表达的上位影响，这表明类胡萝卜素代谢物存在反馈调节。可以合理地假设，还有更多与类胡萝卜素或其衍生物相关的生物学功能正在等待被发现。
由于类胡萝卜素的健康促进功能，研究类胡萝卜素在植物中的生物合成和积累一直是主要关注的焦点。然而，关于类胡萝卜素代谢对其他植物过程的影响的知识仍然相对有限。在自然系统中，例如在柑橘和番茄的果实中，类胡萝卜素的生物合成和积累通常与成熟过程同时发生。可以肯定的是，成熟过程涉及与代谢网络和细胞器修饰相关的细胞活动，最终决定产品质量。
除了对果实品质起作用外，一些代谢产物，如苹果酸和花青素，还新发现了与调节果实代谢、发育和货架期相关的生理功能。Fraser等人发现了增强类胡萝卜素积累对番茄果实中异戊二烯、质体发育和中间代谢的影响。在对类胡萝卜素积累的柑橘突变体的研究中，发现一些与碳水化合物代谢和氧化应激相关的生物学过程与野生型不同。关于类胡萝卜素积累计划如何导致这些意外的代谢变化，人们知之甚少。
发色体形成是富含类胡萝卜素的植物组织成熟过程中最重要的细胞变化之一;它涉及显著的类胡萝卜素隔离和使用其他代谢途径，这些途径对农产品的营养和感官质量都至关重要[17]。染色质体通常来源于先前存在的质体，如支链淀粉或叶绿体，染色体转变通常与组织和器官发育有关。
在发色体发育过程中，形成质体球和类胡萝卜素晶体，发生淀粉分解，淀粉颗粒和类囊体消失，萜类化合物和脂质的代谢大大增强。迄今为止，对染色体发育程序如何建立的理解有限，包括代谢变异和结构重塑在内的关联内部系统仍然表现出复杂的行为。
此外，在烟草花蜜和胡萝卜根中，类胡萝卜素积累与淀粉颗粒发育之间的相互排斥关系表明，增强的胡萝卜素生成是指导从支链淀粉向发色体转变的发育信号。此外，先前在类胡萝卜素工程植物中观察到色质体形态的改变，这表明细胞结构有可能适应以促进新形成的类胡萝卜素的隔离。
除了类胡萝卜素的生物合成外，花青素的积累是一些水果成熟过程中的重要生物事件。花青素是植物酚类次生代谢产物，是苯丙烷途径的一部分。与类胡萝卜素一样，它们参与一系列关键的生物过程，如抗氧化保护和生殖引诱剂的产生，它们对于保护人类健康也是必不可少的。花青素可以与植物组织和器官中的类胡萝卜素共存，但在一些富含类胡萝卜素的器官中，花青素积累相对较少。在高尔拉姆齐花和番茄果实中观察到这种现象。
目前尚不清楚类胡萝卜素和花青素之间是否存在负相关关系，这是一个很难回答的问题。类胡萝卜素和花青素通常参与伴随自然发育的并行生物合成过程，这使得定义因果关系变得困难。对于其他假设的类胡萝卜素相关生物过程也进行了类似的观察。
最近，遗传操作已成功用于许多植物，以修饰胡萝卜素生成和其他质量相关成分。在这些具有靶向代谢途径修饰的工程植物中，发生了各种意想不到的生理、生化和细胞变化。工程系统似乎为调节给定代谢物的积累提供了一种有效的方法，并且它们有助于识别结合生物学关系。
ECM 转录模式
通过柑橘胚性愈伤组织中过表达35S：：CrtB产生的工程细胞模型（ECM）显示出类胡萝卜素的惊人积累。然而，对与工程类胡萝卜素积累相关的其他生物过程知之甚少。因此，为了进一步理解细胞对增强类胡萝卜素生物合成的反应，我们使用了三种代表性的ECM及其在Affymetrix微阵列分析中的野生类型。
确定了上调或下调超过2倍（ECM/WTs，P<0.05）的基因，但M-1/WT数据中的基因使用了5.0倍的宽松阈值（ECM/WTs，P<05.33）。之所以使用这种宽松的阈值，是因为M-33与其野生型之间相对缺乏差异表达基因，这很可能是由于沼泽葡萄柚基因型中类胡萝卜素积累的强烈适应。
为了验证微阵列数据，对三种具有代表性的ECM及其野生型进行了定量实时PCR（qRT-PCR）实验。共选择10个基因，设计基因特异性引物。线性回归分析显示总体相关系数为R 2qRT-PCR 和微阵列数据之间的 = 0.6605，这证实了微阵列数据是可靠的。
此外，基因注释显示，在1个ECM中，大量上调基因被注释为编码过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和富含羟脯氨酸的糖蛋白家族蛋白。下调基因主要编码蛋白激酶、锌指家族蛋白、富含甘氨酸的蛋白和衰老相关因子。
ECM中的氧化还原状态发生了显著变化
POD、GST、富含羟脯氨酸的糖蛋白家族蛋白、热休克蛋白和USP家族蛋白通常被认为是植物中重要的胁迫反应因子。有趣的是，我们的微阵列显示，这些与应激相关的基因，尤其是POD，在ECM中被显著诱导。
对亚细胞定位和差异表达POD类别的预测表明它们是细胞外III类过氧化物酶。工程化类胡萝卜素修饰会干扰ABA水平，这可能与ECM中观察到的应激和氧化还原反应有关。然而，比较分析表明，与相应的野生型相比，ABA含量仅在RB ECM中较高，而在M和SBT ECM中则比较高。
此外，通过愈伤组织中的RT-PCR分析验证了微阵列数据中的几个差异表达基因，这些基因包括WRKY75，蛋白酶抑制剂基因，富含羟脯氨酸的糖蛋白家族蛋白基因和USP家族蛋白基因。因此，我们研究了愈伤组织中的ROS水平。NBT染色显示超氧自由基（O2 -）与野生类型相比，ECM中的水平显着降低。相比之下，过氧化氢（H2O2）水平显示出意外的增加。这一结果证实了微阵列数据，该数据揭示了许多应激和氧化还原反应基因被上调;H2O2在应激反应中具有信号传导作用。
类胡萝卜素积累改变了ECM中的淀粉代谢
α-淀粉酶基因的明确诱导及其酶活性升高表明ECM中淀粉代谢的修饰。这为解释在ECM中观察到的一些现象提供了关键线索。例如，它们通常具有减少的干重，并且它们的细胞学谱通常显示比野生类型更少的淀粉颗粒。
因此，我们研究了愈伤组织中的淀粉水平。与相应的野生类型相比，ECMs的淀粉含量降低，这与碘染色的结果一致。此外，我们分离了淀粉颗粒，并注意到野生类型中的淀粉颗粒比ECM中的淀粉颗粒多得多。随后的SEM研究表明，ECM细胞中没有大的淀粉颗粒。我们还发现ECM在ECM中具有较高的可溶性糖（果糖，葡萄糖和蔗糖）含量，这表明ECM中淀粉代谢的生化改变。
淀粉含量降低与柑橘中类胡萝卜素的显着积累同时发生
我们通过在早开花的柑橘亲戚香港金橘中过表达35S：：CrtB来产生转基因植物。CrtB基因的过表达导致花瓣，根和其他组织的橙色色素沉着，这表明类胡萝卜素积累增加。使用光学和电子显微镜的细胞检查显示橙色组织中质体的显着改变，这导致先前存在的质体显示出色质体样特征。例如，在野生型组织中，在花和深色生长的根中发现支链淀粉，在深色生长的胚状体中发现乙粒体，在老叶柄和光生长的根中发现叶绿体，所有这些质体都显示出显着的淀粉颗粒沉积。
类黄酮/花青素的生物合成受到类胡萝卜素积累的负面影响
在ECM中，与次级代谢相关的转录变化是明显的。特别是类黄酮/花青素生物合成基因的转录在ECM中受到抑制。此外，我们还测试了查耳酮合酶（CHS）和查耳酮异构酶（CHI）（类黄酮生物合成的关键酶）在转基因金橘根部的表达及其对照。qRT-PCR分析显示，CHS和CHI基因在转基因金橘橙根中的表达水平均低于野生型对照。
这些结果表明，类胡萝卜素对类黄酮/花青素积累有负面影响。柑橘胚源愈伤组织和根不含花青素，因此很难在这些组织中研究这种表型。为了研究这种负相关关系，我们通过使用35S：：CrtB结构设计富含花青素的支原体愈伤组织来建立苹果ECM。CrtB基因的过表达导致苹果ECM中总类胡萝卜素水平增加3.68倍。
通过细胞检查也可以观察到丰富的类胡萝卜素积累，这表明苹果ECM细胞在质体中形成许多质体球，但野生型细胞中的质体充满了淀粉颗粒。值得注意的是，在可见光下，野生型愈伤组织含有丰富的花青素，但苹果ECM显示花青素积累最少。
我们对柑橘愈伤组织转录模式的研究将类胡萝卜素积累与氧化还原状态、淀粉代谢和类黄酮/花青素积累联系起来。这些生理过程的存在通过生化和细胞学分析以及柑橘愈伤组织、辛德斯温格尔纤维和胡佩亨斯猂蝉中类胡萝卜素生物合成的遗传操作进一步阐明。我们的研究结果为类胡萝卜素积累的复杂性及其相关的生物过程提供了新的视角。
例如，我们证实，大量的类胡萝卜素积累会导致愈伤组织系统和花瓣和根部等组织中的淀粉降解。这些模型系统产生的数据提供了重要的信息，可以促进对其他植物系统成熟过程中淀粉代谢和类胡萝卜素积累的理解。同样重要的是，我们的发现通过提供密切考虑更广泛的特征（如植物抗性和系统代谢修饰）所需的知识，对类胡萝卜素代谢工程具有重大意义。
特别是，在类胡萝卜素代谢工程植物中，应避免与类胡萝卜素积累相关的花青素水平降低。花青素是亲水性膳食抗氧化剂的重要来源，富含可溶性和亲脂性抗氧化剂的水果和蔬菜被认为提供最佳的健康保护。
