2009 年，一篇關於單細胞 mRNA 測序的研究論文在 Nature Methods 上發表，自此全面拉開了單細胞測序產業發展序幕。
單細胞測序是在單個細胞的水平上對基因組或轉錄組進行提取擴增和高通量測序分析的一項新興技術，作為近十年來生命科學領域的一項重大技術，其應用前景被廣泛看好。與此同時，全世界越來越多的企業湧現並加入這一賽道，行業競爭日趨激烈。
在全球範圍內對比，國內單細胞測序產業起步稍晚，技術、產品以及市場份額等都被海外公司所主導。為了避免將來被“卡脖子”，國內企業從源頭開始自主研發單細胞測序技術和產品很有必要。
作為一家以創新技術為驅動力的企業，墨卓生物基於液滴微流控技術積澱從源頭創新，自主開發端到端的高通量單細胞測序完整解決方案，從技術到產品全鏈條推動國內單細胞測序產業發展進程。
近日，生輝邀請到墨卓生物 CTO 鄭文山博士，圍繞源頭創新、產品、技術、產業等多個維度來對單細胞測序行業進行解讀。
▲圖｜墨卓生物 CTO 鄭文山博士（來源：受訪者）
緣起：佔據源頭創新高地
從師出名門到產業化實踐
從北京大學化學系本科畢業之後，鄭文山進入哈佛大學攻讀博士學位。他本科的研究方向為納米材料合成。“當時我研究的課題雖然不屬於生物技術，但本質上是屬於方法學開發。截至目前，這也一直都是我的研究方向——在不同領域的方法學開發。”他說道。
在哈佛大學，鄭文山師從美國三院院士、中國工程院外籍院士 David Weitz 教授。David Weitz 教授是液滴微流控領域奠基人之一，也是將液滴微流控應用於高通量單細胞測序技術的發明人。
鄭文山博士期間的研究方向主要圍繞液滴微流控領域，比如採用液滴微流控進行高通量單細胞測序，包括真核生物轉錄組和微生物基因組等。目前，他已在 Science、Nature Communications 等高水平國際期刊上發表論文十餘篇。
談及創立墨卓生物的初衷，鄭文山坦言，在哈佛大學求學期間，他與另外兩位創始人裴顥博士、劉寒博士都希望能夠產生一些大而正向的影響：把所學知識應用到產品開發，以此來幫助和惠及更多的人。“哈佛大學的創業氛圍非常濃厚，而且哈佛大學所在的波士頓是全球生物科技創業的聖地，我們在求學期間受到了很多這方面的熏陶和影響。”他補充說。
2018 年，他們在美國波士頓的哈佛大學校園聯合創立了墨卓生物。
▲圖｜從左至右分別為首席運營官劉寒、首席執行官裴顥、首席技術官鄭文山（來源：公司官網）
之所以選擇回國落地，“首先，我們看到在國內，生物技術領域和國外還存在一定差距，我們希望能夠用實際行動，為推動國內生物技術產業進步貢獻一份力量；其次，國內整體環境大力支持創業創新，包括國家政策和地方政策都非常利好；再次，國內周邊配套，不論是硬件設施還是科研團隊等都已經非常健全完善，在國內發展前景更為廣闊。”鄭文山表示。
懷揣這份熱忱，他們於 2020 年回國，並將墨卓生物落地浙江嘉興。
▲圖｜墨卓生物（來源：公司官網）
目前，鄭文山擔任墨卓生物的首席技術官，專註於創新技術研發，David Weitz 教授是公司的首席科學家。“液滴微流控是墨卓生物的核心技術，這也是我在博士期間跟隨 David Weitz 教授的主要研究課題，即液滴微流控技術在生命科學領域的應用和技術開發。”鄭文山表示。
在鄭文山看來，墨卓生物是一家真正以用戶需求為本、以產品為中心的生物技術公司。“我們團隊內部思路高度一致，貫徹以產品為中心的企業理念，通過深入挖掘用戶的需求，各個部門齊心協力開發高質量、高完成度的能夠切實滿足用戶需求的創新產品，服務生命科學，造福人類健康。”他說，“‘用生命科學服務人類健康’，這既是公司的願景，也是我們自己的一個願望。”
產品：從源頭自主設計首款產品
達到國際主流水平
今年，是墨卓生物首套產品的商業化元年。
作為一家以產品為中心的生物技術公司，墨卓生物歷時數年打造的首套產品——MobiNova® 高通量單細胞轉錄組解決方案已於今年4月上市。
▲圖｜墨卓生物 MobiNova® 高通量單細胞轉錄組解決方案（來源：公司宣傳資料）
MobiNova® 高通量單細胞轉錄組解決方案是一套覆蓋了儀器、試劑和生信分析軟件的完整解決方案，由 MobiNova®-100 高通量單細胞測序建庫系統、MobiCube® 高通量單細胞轉錄組試劑盒和 MobiVision® 生信分析軟件組成，全流程覆蓋高通量單細胞轉錄組實驗的需求。
據了解，MobiNova® 高通量單細胞轉錄組解決方案的細胞分群質量與國際主流產品質量不相上下，細胞捕獲率達 70%，且可捕獲稀有細胞類型，每 10000 個細胞中多胞率<5%。
達到高水平的性能指標，在鄭文山看來，主要是得益於墨卓團隊的技術積累。“採用液滴微流控技術來進行高通量單細胞測序，這其實也是我們墨卓創始人 David Weitz 團隊的首創。從微流控技術的發明到後續的拓展應用研發，多年來我們擁有深厚的技術沉澱和經驗積累。”他說，“而在實際的產品開發中，由於整套產品體系比較複雜，因此還需要儀器、微流控芯片、試劑、生信等各個端口相互高度協作配合，實現對於每個端口的精準控制。這就要求我們進行自主的、從零開始的設計、研發以及產業化。”
具體而言，“我們通過優化微流控芯片的設計和儀器控制，在液滴生成時穩定實現細胞分離和微球、試劑、細胞的共包裹，從而達到較高的細胞捕獲率。同時，通過液滴的高速生成來確保每 1 萬個細胞中的多胞率控制在 5% 以內。”鄭文山介紹道。
此外，不同批次數據穩定性和實驗的可重複性向來是行業痛點，也是最難解決的挑戰之一，因為這是對綜合性能的考量，既需要儀器足夠精密，也需要試劑足夠穩定，甚至對實驗流程的方便性都有極高要求。放眼整個科研儀器和體外診斷行業，國產儀器與進口儀器的最大差距正是於此。
MobiNova® 單細胞轉錄組解決方案的不同批次數據穩定性和實驗的可重複性亦是達到國際領先水平。對此，鄭文山表示，“正如剛才提到的，整套系統的儀器、微球試劑、生信軟件、微流控芯片等，各個端口之間需要緊密配合，大到核心部件，小到一個工序，我們全部都是從源頭做起，進行自主研發生產，因此能夠實現對整個流程的精準把控，所以我們產品得到的實驗數據具有很高的穩定性，批次內穩定性和批次間穩定性都非常高。”
“總而言之，我們擁有完整的自主知識產權，整個系統全都可以在內部進行研發和改進，因此，我們能夠通過不斷的打磨產品，從而實現較高的性能參數指標，與國際主流產品質量平齊。”鄭文山總結說。
技術：從替代到超越
三大技術創新佔據國際領先
打造一款卓越產品自然離不開先進技術的加持。
就目前而言，高通量單細胞測序主要有兩大技術路線，一個是微孔法，一個是液滴法，兩條技術路線各有千秋。
作為墨卓生物的核心技術——液滴微流控，其優勢是把每個液滴都變成一個個微型“反應器”，能夠大幅提高通量、降低成本。鄭文山表示，“在讀博期間，我就希望能把液滴微流控技術真正地實現產品化，而將液滴微流控用於開展高通量生物學實驗便是一個非常好的應用方向，可以讓更多用戶使用到這種先進技術，為生命科學研究提供助力。”
▲圖｜墨卓生物試劑研發實驗室（來源：公司官網）
為了保證產品的優越性能和穩定性，墨卓生物在已有的液滴微流控技術基礎上進行了進一步的創新，自主研發了細胞和試劑“分區”設計、微球包裹高速流道，以及 Lightcut™ 光激發分離三大創新技術。
據了解，細胞和試劑“分區”設計是為樣本細胞設計了一條獨立的流道，因而將原來的 2 個水相流道和 1 個油相流道，增加到了 3 個水相流道和 1 個油相流道，能夠最大程度減少對細胞的干擾。
“這樣設計的難點在於，更多的流道之間會產生更多的相互作用，從原來 3 個流道的兩兩相互作用，變成 4 個流道的兩兩和三三相互作用，整體複雜度多了數倍，控制難度大幅增加，而且對於微流控流道設計、液滴的生成，芯片表面修飾等都提出了更高的要求。”鄭文山介紹道，“微流控領域是墨卓生物團隊的專長，我們針對這個難題進行技術攻關並妥善解決，目前，在現有的系統上能夠實現高穩定性液滴的生成。”
對於包裹微球的高速流道，“這裡的高速，指的是生成液滴的頻率比較高，意味着能夠在單位時間內生成更多的液滴。”鄭文山指出。想要實現高速，他總結了以下 3 個方面：
第一，結構設計。流道的結構設計要能非常穩定地生成液滴。
第二，表面疏水。“流道的表面進行疏水處理，比如我們目前使用的是‘油包水’的液滴，這對芯片表面修飾提出很高的要求。”他解釋說。
第三，系統控制。比如對系統的壓力參數等實現精密的調控。
“最終，在這三個方面的協調配合下，我們的產品可以實現每秒鐘生成幾百到幾千個液滴。”鄭文山說道，“這樣的速度可以大幅縮短上機時間，提升實驗效率，可以極大地減少 mRNA 在實驗過程中降解的可能性，獲得更穩定和優越的實驗結果。”
“而在液滴生成後，我們期望在液滴內部進行的反應是一個‘均相反應’，即引物與需要捕獲的 mRNA 分子都在水相中，所以，我們需要把微球上連接的引物釋放出來。”他指出。
據介紹，傳統的方法是不進行釋放，但是界面反應會降低反應效率；另一種方法是把微球進行溶解，但是微球裡面複雜的成分會進入到體系中，對體系內的 mRNA 反轉錄效率等方面可能產生嚴重干擾。
上述兩種方法都存在局限性，相較之下，“我們的新方法是在微球和引物之間加入一個新的對特定波長的光敏感的連接鍵，在經過特定光的激發之後，引物就會可控地釋放出來，這就是 Lightcut™ 光激發分離技術。”鄭文山解釋說。
細胞和試劑“分區”設計、微球包裹高速流道和 Lightcut™ 光激發分離這三大自主開發的創新技術，讓墨卓生物的產品擁有了更進一步的優越性能和穩定性。目前，這三大技術已全部應用在 MobiNova® 高通量單細胞轉錄組解決方案中。
突破：創新發明微生物
高通量單細胞基因組學技術
除了應用於動植物的單細胞測序領域，墨卓生物近期在微生物單細胞領域也取得了創新突破。
今年 6 月，鄭文山作為並列第一作者在 Science 發表了題為“High-throughput, single-Microbe genomics with strain resolution, applied to a human gut microbiome”新研究論文，開發出微生物高通量單細胞基因組學技術——Microbe-seq，這是微生物群落研究方法學上的一項重大突破。而就在去年，國家自然科學基金委在其項目指南中也明確提出了鼓勵開展微生物單細胞的研究。
▲圖｜相關論文（來源：Science）
相較於目前常規的微生物菌群宏基因組測序技術，高通量單細胞測序技術具有壓倒性優勢。據鄭文山介紹，一個微生物群落樣本中往往包含各種不同的微生物，其構成非常複雜，其中不同的物種可達上百甚至幾千種。傳統的宏基因組方法是把所有的核酸從所有的微生物中提取出來再進行測序，而每一段核酸的序列來自於哪個微生物細胞，在實驗端無法進行特殊處理，只能藉助生信端來進行分析，具有一定的局限性。
相較之下，單細胞測序則可以把每一個細菌內的核酸標記一個特殊的編碼，測序完成之後能夠把它的序列再重新進行關聯起來，如此一來，在實驗端就已經把“哪些序列來自哪個微生物細胞”的難題解決，大幅提升了結果的精準度和可靠性。
因此，這種針對微生物的高通量單細胞測序技術，能夠讓科研工作者真正深入地去研究微生物菌群基因組學，把測得的每一個序列之間的關聯性闡釋清楚，得到的結果也會更加可信，由此還可以去拓展研究一些複雜的微生物群落的特徵。
相較於動植物的單細胞測序側重於轉錄組，墨卓現階段微生物的單細胞測序側重於基因組，對此，鄭文山表示，“對於微生物的組學而言，目前的研究還是相對偏早期，即使要研究轉錄組，也往往需要先獲取高質量的基因組信息作為基礎。因此這個階段對於微生物基因組的需求相對更大一些。”
兩種技術既有交叉，也有不同。具體而言，“在我們開發的體系中，兩者都採用液滴微流控技術，而液滴在這個過程中充當“高通量反應器”的功能。高通量單細胞測序，我們會在液體內部把每一個細胞的核酸（RNA或DNA）採用分子標籤（barcode）進行標記，如此一來，每個細胞的核酸都會有一個 DNA 序列（分子標籤）與之相關聯，這是兩項技術在原理上的相似之處。”鄭文山介紹說。
不同點則體現在多個方面，比如，細菌的單細胞測序需要在微流控體系內把細胞壁打破，而對於動植物細胞來說，動物細胞沒有細胞壁，植物細胞一般在上機前就已經完成了破壁，不需要在微流控體系中納入破壁的步驟。“此外，動植物的單細胞轉錄組測序關注的是 mRNA，mRNA 會有一段 poly A 序列作為一個通用的固定接頭，可以比較容易地被捕獲。但細菌的基因組是連續和相對隨機的，它沒有固定的序列可以用來作為捕獲接頭，所以我們在這個流程中還需要去給它的基因組添加作為捕獲接頭的序列。”鄭文山解釋說。
“還有非常關鍵的一點，mRNA 的長度會短一些，一般為數百到數千個鹼基，一般情況下，測幾十個鹼基就能夠確定基因。相較之下，基因組則很大，一般有數百萬個鹼基，所以，這就需要把它打斷到一個比較合適於進行測序的長度。所以，微生物菌群的高通量單細胞測序會面臨很多新的技術挑戰。”他補充說。
▲圖 | 微生物高通量單細胞基因組測序實驗原理（來源：Science）
在鄭文山看來，“高通量單細胞測序技術本身是一個比較革新性的、能夠從新的維度和分辨率來研究生物學問題的方法，是屬於比較底層的技術革新。所以，關於微生物研究中的方方面面都能夠受益於高通量單細胞測序技術。”
因此，傳統採用宏基因組學進行研究的應用場景，都可以使用微生物高通量單細胞基因組學來進行更加深入的研究，可以更好地分析一個複雜的微生物樣本中都有哪些微生物、其基因組序列是什麼、有哪些潛在功能等等，還可以探索微生物對人體健康的影響，例如分析微生物在癌症治療中對預後的影響。同時，在農業中，土壤微生物也與農作物的生長密切相關，通過微生物高通量單細胞測序可以更好地分析它們的關聯性和因果關係，幫助提高農業產量、抵禦病害等。
除了傳統應用場景外，新技術也讓微生物研究能夠觸及到以往技術所不及的地方。例如，由於微生物高通量單細胞基因組測序能夠獲得更加完整、精準度更高的細菌基因組序列，因此不僅能夠更加精準地分析樣本中的不同菌種，還能分析同一菌種中有哪些不同菌株，甚至深入分析不同菌株的功能差異。同一菌種的不同菌株在致病性、功能、代謝通路方面可能大相徑庭，因此這對於農業、環境和臨床醫學都有着非常重要的意義。
對於該技術的轉化，“我們目前已經搭建了一整套的實驗平台，能夠為客戶提供科研服務支持，與之配套的儀器和試劑也都在開發中，我們希望在兩年內能夠推出針對於微生物高通量單細胞測序整套儀器、試劑、芯片和生信軟件的解決方案。”鄭文山表示。
產業：聯手打造多元、高效的
單細胞測序新生態
就現階段而言，限制單細胞測序技術廣泛應用的瓶頸之一是價格過於昂貴。比如，目前國際市場佔有率較高的公司，進行單個樣本實驗的試劑成本已超 1 萬元人民幣，因而進行一組簡單的生物實驗花費多達 10 萬元人民幣以上。所以，市場對於“降本”的需求非常強烈。
據介紹，圍繞整體解決方案的“降本”，墨卓生物開展大量研究工作，主要涵蓋 3 個層面：
第一，技術優化改進。“針對一些關鍵步驟，我們通過提高產率，比如把產率提高 5-10 倍，那麼這個關鍵步驟的成本就降到以前的 1/5 甚至是1/10。”鄭文山說。
第二，大規模生產。一般來說，任何工業產品在大規模生產之後成本都會有所下降，通過規模化量產也是降低成本的一種方式。據了解，墨卓生物目前已建成超 4000 平米的辦公區、實驗室和廠房，其中包括 P2 細胞實驗室、PCR 擴增實驗室和 800 平米的十萬級 GMP 生產車間，為大規模化生產提供保障。
第三，高質量的原材料國產替代。“我們最初的研發階段所採用的原材料大都以國外進口為主，如今隨着國產生物試劑的發展，其性能參數與國外試劑已經不相上下，所以我們也在逐步進行高質量國產原料的替代來實現成本的降低，從而讓單細胞測序技術能夠惠及更多科研工作者以及終端用戶。”鄭文山補充說。
“目前，檢測單個樣品的成本超 1 萬元人民幣，我們希望在未來幾年能夠把整體的單細胞測序解決方案成本降到目前的 1/10。”鄭文山表示。
除了把整體解決方案的成本降低，墨卓生物現階段還聚焦多組學和多樣本類型進行發力。“單細胞測序領域多組學是一大趨勢。大部分廠商都專註於轉錄組，而我們在轉錄組的基礎上也在開發其他組學，比如表觀遺傳組、蛋白組等。而針對轉錄組我們已經推出產品，目前在持續優化中，同時針對全長轉錄組，以及集中於 5’端跟免疫相關的產品也都會陸續推出。”鄭文山介紹道。
“此外，目前大部分高通量單細胞測序儀器和試劑盒都只適用於新鮮樣本，我們一方面把高通量單細胞測序技術從真核生物細胞拓展到原核生物細胞；另一方面，也在把單細胞測序產品的應用範圍拓展到包括 FFPE 樣本等更多類型。”他表示。
談及墨卓生物中長期發展規劃，鄭文山表示，“我們主要專註於深耕單細胞測序領域。首先，開發高質量的‘中國方案’，在性能和國外產品基本一致的前提下，實現整體解決方案價格的大幅降低；其次，持續發力產品端，實現單細胞測序的多組學覆蓋，同時拓展更多樣本類型；除此之外，我們還希望從應用端深入挖掘一些未被滿足的用戶需求，以此來反向開發和優化產品，把單細胞測序技術應用到臨床檢測、製藥開發等領域，解決更多未被滿足的臨床需求。”
對於公司在發展過程中可能會遇到的挑戰，在鄭文山看來，“首先，作為一家初創公司，不論從融資層面還是團隊成長層面，墨卓生物的發展都較為迅速，所以公司團隊管理層面對我們提出了更高的要求；其次，我們深知想要成為一家大型生物技術公司，需要讓產品能夠惠及全球客戶。今年是墨卓生物的商業化元年，現階段我們主要紮根中國大陸，海外布局才剛剛開始，所以在未來全球化出海布局的過程中我們可能會面臨一些新的挑戰。當然，這些挑戰也是我們在未來需要不斷完善和努力的方向。”
宏觀產業層面，鄭文山指出，高通量單細胞測序技術就好比是“測序領域的顯微鏡”，傳統的整體樣本測序得到的是整體平均值，而單細胞測序可以得出精確到單個細胞的信息。“先前很多研究我們關注到的只是整體，而如今藉助單細胞測序技術，我們能夠把整體中的每一個個體進行觀察和分析，這就相當於把研究的邏輯和視角提升到一個嶄新的維度。”他補充說。
“更為關鍵的是，在全球層面，單細胞測序是一個相對比較新興的技術，這也是中國可能在國際生物技術和應用領域進行彎道超車的一個潛在賽道。”鄭文山指出，“中國佔據全球大約 1/4-1/5 的市場份額，與此同時，隨着國家對新興技術研發的投入和重視也在逐步增強，國內的市場規模在未來會持續快速增長，這個比例還將會進一步增加。”
“放眼國內，整個單細胞測序產業鏈其實是很廣的，而我們在產業鏈中所扮演的角色是產品開發和優化。我們立足這個環節中開發出更多高質量、高性價比，能夠切實滿足用戶需求的創新產品，同時，在此基礎上，我們與上游的高質量國產原料供應商，與下游的科研服務機構，以及與終端用戶（如科研人員、臨床醫生、藥物開發人員等）一起攜手合作，共同構建和推進蓬勃發展的單細胞測序產業新生態。”鄭文山總結說。
參考資料：
1.http://doi.org/10.1126/science.abm1483
2.https://www.mobidrop.com/
3.https://www.mobidrop.com/single-cell-sequencing-platform
