大家好，今天分享的是一篇2025年12月發表在Food Chemistry上的「Tannase-catalysed gallic acid release for clean-label inhibition of green tea auto-oxidative browning」
該文章利用單寧酶催化水解綠茶中天然存在的沒食子醯類結合物，原位釋放沒食子酸，通過降低茶湯pH來抑制氧化褐變。藉助UHPLC-HRMS與NMR等技術，在綠茶中鑒定出75種沒食子醯化合物，系統闡明了單寧酶對底物骨架、立體構型及取代位置的選擇性規律。結果顯示，酶處理可釋放91.7%的結合態沒食子酸，將pH降至4.6，顯著減輕褐變。該方法無需外源添加劑，為即飲綠茶提供了綠色、安全的貨架期穩定化新策略。
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天然酚類化合物
天然酚類化合物沒食子酸可以作為茶葉的自氧化供體。在茶中，沒食子酸（GA）主要以束縛態形式存在。沒食子醯化是指沒食子醯基與各種支架的連接，通常通過一個酯鍵連接。在綠茶中，這些支架包括黃烷-3-醇(圖1a)，原花青素(圖1b)，有機酸(圖1c)和葡萄糖(圖1d)。沒食子醯化化合物如表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、茶棓素和沒食子醯葡萄糖衍生物，通常被稱為水解單寧。因此，綠茶中天然含有種類繁多的沒食子醯化成分化合物，以及一些遊離的GA。結合的沒食子酸部分作為沒食子醯化化合物的一部分，在綠茶中具有潛在的可降解GA的能力。
作者研究了單寧酶催化釋放的沒食子酸能否用於抑制RTD綠茶中的自氧化細菌。利用超高效液相色譜(UHPLC)結合高分辨質譜(HRMS)對綠茶中的沒食子醯基化合物進行了全面的鑒定，包括診斷性成素依賴性化合物的發現。檢測了單寧酶對這些沒食子醯基化合物的水解能力。定量分析了單寧酶催化的GA釋放酶，以及它對茶葉pH和自氧化細菌的影響。
圖1
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對可水解的合金化合物進行表徵
作者通過UHPLC - HRMS和酶水解相結合的方法，實現了對單寧酶水解能力的篩選。首先對超高效液相色譜-高分辨質譜（UHPLC-HRMS）分析獲得的二級質譜（MS²）碎片數據進行篩選，尋找與結合態沒食子酸（GA）基團相關的特徵碎片離子與中性丟失（NL）信號。通常，含1個、2個或多個沒食子酸基團的沒食子醯化化合物會出現以下特徵中性丟失：丟失沒食子酸基團（152.01096u，C₇H₄O₄），或丟失沒食子酸基團+水分子（170.02152u，C₇H₆O₅），並同時產生特徵碎片離子m/z 169.01425（C₇H₅O₅，沒食子酸離子）。將高分辨質譜（HRMS）測得的候選沒食子醯化化合物的元素組成或碎片信息與文獻或人類代謝組資料庫進行比對，或將其保留時間與質譜數據與商業標準品或實驗室自製純化標準品進行比對，從而完成候選物質的定性鑒定。
其次，採用無花果麴黴單寧酶進行酶解處理，以驗證這些沒食子酸（GA）基團是否可被水解。利用文章中建立的分析方法，在混合綠茶中共鑒定出約70種含沒食子醯基的化合物，這些化合物具有多種母核骨架。所有以黃烷-3-醇或二聚黃烷-3-醇為骨架的沒食子醯化化合物，以及大多數以己糖或有機酸為骨架的沒食子醯化化合物，均被證實可被水解（圖2a），但單寧酶對這些化合物的水解偏好性存在明顯差異。基於該實驗，單寧酶對已鑒定的可水解沒食子醯化化合物的偏好性以t¾表示，即化合物被水解75%所需的時間。為定量比較單寧酶對不同沒食子醯化化合物的水解偏好，按t¾將其劃分為5個等級：極佳（300min）（補充材料Ⅱ）。
單寧酶處理300min後，初始黃烷-3-醇峰面積僅剩餘0.1%，二聚黃烷-3-醇僅剩餘0.2%，處理1140min後這些化合物可完全水解（圖2）。然而，以葡萄糖和鞣花醯葡萄糖為骨架的可水解單寧，300min後仍剩餘43.2%，1140min後仍有33.3%未被水解。對於沒食子醯化有機酸，300min後峰面積剩餘59.1%，1140min後仍剩餘19.9%。
圖2
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單寧酶對黃烷-3-醇的偏好性
表兒茶素沒食子酸酯（ECg）及其差向異構體兒茶素沒食子酸酯（Cg），以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCg）及其差向異構體沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCg），是混合綠茶中主要的天然單沒食子醯基化黃烷-3-醇，其峰面積約佔沒食子醯化類化合物總UHPLC‑HRMS峰面積的63.4%。四種沒食子醯化黃烷-3-醇均可在300分鐘內完全水解，但t¾（75%水解時間）存在明顯差異（圖3a）。根據t¾值，這四種主要黃烷-3-醇的水解效率可劃分為：ECg（極佳）對Cg（中等），EGCg（良好）對GCg（較差）。因此，表型異構體（epi‑型）的水解速率顯著快於其對應的非表型異構體。
具有兩個沒食子酸酯部分的黃烷-3-醇，即單體黃烷-3-醇雙沒食子酸酯，在綠茶中也有少量存在(占混合沒食子酸酯化合物總UHPLC-HRMS峰面積的1.5%)。從Aspergillus ficuum的單寧酶菌株的代謝產物中分離出單一的黃烷-3-醇二聯體，其t¾值一般小於30min，從而導致單寧酶菌株在30min內接近完全水解(圖3b)。黃烷-3-醇雙沒食子酸酯類化合物的降解可能是含有兩個GA基團的化合物水解的結果，這兩個GA基團的水解都導致了原化合物的損失。
圖3
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可水解的單寧不一定能被單寧酶水解
混合綠茶中沒食子醯基型化合物占該類化合物總峰面積的16.2%，含量最高的水溶性單寧為1,4,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose。混合矢車菊茶中主要含四沒食子醯基-葡萄糖，未檢出五聚體，並鑒定出多個二沒食子醯基-葡萄糖和單沒食子醯基-葡萄糖異構體。
三沒食子醯基-葡萄糖水解時濃度持續下降，其中天然存在的1,4,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose是單寧酶的優良底物。二沒食子醯基-葡萄糖水解模式相似，其天然異構體持續下降，而同系物則先積累後完全水解。
作者發現單沒食子醯基-葡萄糖的水解模式最複雜：天然異構體D持續下降；異構體A、B、E、F先積累後緩慢下降；異構體C非天然存在但會積累並保持穩定。這表明多沒食子醯基-葡萄糖的水解未必定量產生葡萄糖和遊離沒食子酸，與以往認為鞣酸酶總能將其完全水解的觀點不同。實驗還顯示麴黴鞣酸酶無法水解葡萄糖骨架特定位置的沒食子醯基酯。通過標準品比對僅鑒定出異構體D為1-O-沒食子醯基-β-D-葡萄糖，針對異構體C的位置需進一步實驗確定。
圖4
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非水解沒食子酸酯取代在葡萄糖支架上的位置
為精準定位單寧酶無法水解的沒食子醯基在葡萄糖骨架上的連接位點，作者研究以五沒食子醯葡萄糖、三沒食子醯葡萄糖和1-O-沒食子醯葡萄糖標準品為對象開展酶解實驗，結果顯示酶解後大量積累單沒食子醯葡萄糖異構體C，而1-O-沒食子醯葡萄糖可快速水解，排除C為1位取代異構體。進一步藉助700MHzNMR進行結構解析，通過1HNMR、13CNMR結合HSQC、HMBC、NOESY等二維譜數據確認，該異構體C的葡萄糖C6位質子發生高場位移，表明C6位無沒食子醯基取代，而H4質子呈現明顯低場位移且與沒食子醯羰基碳存在關鍵相關信號，最終確定不可水解的異構體為4-O-沒食子醯-β-D-葡萄糖。該結果首次明確無花果麴黴單寧酶對葡萄糖骨架沒食子醯基的水解具有嚴格位置選擇性，水解偏好順序為C1＞C6＞C4，其中C4位酯鍵無法被水解，打破了單寧酶可完全水解所有沒食子醯葡萄糖的傳統認知，也解釋了酶解後部分可水解單寧持續殘留的核心原因，為深入理解單寧酶底物識別機制提供了關鍵結構依據。
單寧酶催化沒食子醯葡萄糖水解時，除發生位置選擇性水解外，還伴隨顯著的異頭物生成現象，這是導致酶解產物中單沒食子醯葡萄糖異構體數量遠超理論值的關鍵原因。理論上單沒食子醯葡萄糖僅有5種位置異構體，但酶解後檢測到至少6種異構體峰，無法僅用位置異構解釋。已知葡萄糖C1位羥基未取代時可發生變旋現象，在α和β異頭體之間快速轉化，本研究通過環離子遷移譜（cIMS）直接證實，單寧酶水解C1位沒食子醯基後，葡萄糖C1位羥基裸露，可自由發生變旋並建立異頭平衡，與遊離葡萄糖的變旋行為一致。基於此推導，五沒食子醯葡萄糖經酶解可生成最多9種單沒食子醯葡萄糖產物，包含5種位置異構體和4種異頭物，本研究實際檢測到6種，與理論高度吻合。
圖5
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水解模式相似
以HHDP-葡萄糖為骨架的沒食子醯化化合物，在單寧酶催化下的水解規律與葡萄糖骨架沒食子醯化物高度相似，呈現明顯的位置選擇性且無法水解雙酯鍵連接的HHDP基團。這類物質占綠茶沒食子醯化物總峰面積的6.0%，主要成分為1-O-沒食子醯-4,6-HHDP-β-D-葡萄糖，還包含其他4種單沒食子醯-HHDP-葡萄糖異構體和1種二沒食子醯-HHDP-葡萄糖。酶解結果顯示，所有單、二沒食子醯-HHDP-葡萄糖的峰面積均持續下降，其中E異構體水解速率極快，t¾僅26min，屬於極佳底物，60min內可完全水解，而A、B異構體水解極慢，C、D異構體水解較差，差異顯著。進一步追蹤發現，HHDP-葡萄糖濃度在酶解前60min持續上升並保持穩定，證明HHDP結構無法被單寧酶水解。上述結果表明，HHDP基團不影響C1位沒食子醯基的水解，底物水解速率仍由沒食子醯基連接位置決定，與葡萄糖骨架的水解規律完全一致，進一步驗證了單寧酶對C1位沒食子醯基的優先選擇性。
圖6
單寧酶不僅可水解黃烷-3-醇、葡萄糖骨架的沒食子酸酯，對有機酸骨架尤其是奎寧酸型沒食子醯化物同樣具有水解能力，但整體水解效率較低且存在位置偏好。有機酸骨架占綠茶沒食子醯化物總峰面積的14.7%，主要為沒食子醯奎寧酸，其中含量最高的是5-O-沒食子醯奎寧酸（茶沒食子素），同時還檢測到3-O-沒食子醯奎寧酸、4-O-沒食子醯奎寧酸及兩種二沒食子醯奎寧酸異構體。酶解結果顯示，所有沒食子醯奎寧酸的峰面積均緩慢下降，t¾值均屬於極差底物等級，其中5-O-沒食子醯奎寧酸水解速率快於3位和4位取代異構體，表明在奎寧酸骨架上同樣存在位置選擇性。此外，沒食子酸本身作為骨架形成的沒食子酸-沒食子酸酯可被快速水解，屬於極佳底物，而鞣花酸因分子內C-C鍵和雙酯鍵結構無法被水解。特異性實驗證實，單寧酶僅水解沒食子醯酯鍵，對咖啡醯、香豆醯等非沒食子醯酯鍵無作用，體現出嚴格的底物專一性。
圖7
該文章首次證實無花果麴黴單寧酶具備水解甲基沒食子酸酯鍵的能力，甲基化修飾對酶的水解能力影響較小，且水解規律與普通沒食子醯化物保持一致。在混合綠茶中暫定鑒定出3種甲基沒食子醯化黃烷-3-醇和1種甲基沒食子醯奎寧酸，這類物質僅占沒食子醯化物總峰面積的0.1%，含量較低。酶解實驗結果顯示，甲基沒食子醯化黃烷-3-醇的水解效率為中等至極佳，主要受黃烷-3-醇母核影響，與普通沒食子醯化黃烷-3-醇的水解偏好一致；而甲基沒食子醯奎寧酸水解緩慢，屬於極差底物，與普通沒食子醯奎寧酸的水解模式相同。該結果突破了以往單寧酶僅水解沒食子酸酯的認知，將其底物範圍擴展至甲基沒食子酸酯，同時表明甲基修飾不會顯著改變酯鍵的水解特性。
圖8
單寧酶催化釋放沒食子酸可顯著抑制綠茶自動氧化褐變，但無法實現完全抑制，最優抑褐效果出現在300min，延長處理時間無額外提升。酶解過程中，遊離沒食子酸濃度從0.8mM快速升至7.3mM，釋放率達91.7%，茶湯pH從5.8降至4.6，其中53.9%的沒食子酸在30min內快速釋放，300min時pH即達到穩定值，酶活實驗證實酶持續保持活性，平台期並非酶失活導致。加速氧化實驗顯示，酶解樣品的褐變強度（BCI）和色差（ΔEab）均顯著低於對照組，pH與褐變指標高度正相關（R²=0.93、0.88），證明抑褐主要依賴pH降低。但由於pH4.6未達到完全抑褐所需的4.1以下，且40℃長時間孵育會促進殘留酚類氧化，導致300–480min褐變略有回升，後續因多酚聚合溶解度下降褐變輕微降低。綜合來看，單寧酶可作為清潔標籤抑褐手段，但需與其他策略結合才能實現完全抑褐，300min為工業應用最優時長。
文章信息：
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2025.147775
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