大家好，今天推送的文章發表在Nature Communications 上的「Continuous evolution of a halogenase enzyme with improved solubility and activity for sustainable bioproduction」。
鹵化反應能增強藥物和生物材料的功能，但現有鹵化酶（如色氨酸鹵化酶RebH）存在溶解度低、活性差、溫度敏感等問題，嚴重限制了其在體內的應用。本研究開發了一種基於氨醯‑tRNA合成酶（aaRS）的生物感測器，將7‑氯色氨酸（7‑Cl‑Trp）的生成與sfGFP熒光偶聯，實現對鹵化酶活性的高通量檢測。隨後將該感測器改造為M13噬菌體依賴的篩選系統，通過噬菌體輔助連續進化（PACE）對RebH進行超過500小時的定向進化，最終獲得含有12個突變的變體RebHEvo4。該變體在37°C下催化7‑Cl‑Trp和7‑Br‑Trp的產量分別比野生型提高37倍和44倍，且溶解度顯著提升。在5 L補料分批生物反應器中，RebHEvo4可生產2.7 g/L的7‑Cl‑Trp。將其與色氨酸脫羧酶RgnTDC偶聯，鹵化色胺產量提高24‑36倍；用於抗菌肽的位點特異性鹵化修飾，可實現無需外源非天然氨基酸的高效生物合成。本研究為綠色生物製造鹵化藥物和肽類提供了高效酶工具。
鹵化化合物在現代醫藥和農業中佔據核心地位：約25%的上市藥物和超過80%的農用化學品含有鹵素原子，可顯著提高生物利用度和穩定性。傳統的化學鹵化方法常需苛刻的腐蝕性試劑，且缺乏區域和對映選擇性。酶促鹵化作為一種綠色、區域選擇性的替代策略備受關注，其中以色氨酸鹵化酶（如RebH）研究最為深入。RebH利用黃素輔因子原位生成次鹵酸（HOX），在色氨酸吲哚C7位進行親電鹵化。然而，該類酶普遍存在溶解性差、催化活性低、底物抑制和溫度敏感等問題，導致體內發酵產量極低（通常為毫克級），反應速率緩慢。儘管前期通過定向進化已獲得部分熱穩定性或底物譜拓寬的變體，但尚無同時提高溶解性和體內活性的報道；實際應用中仍需依靠融合促溶標籤或共表達分子伴侶來部分克服缺陷。因此，亟需開發一種能夠直接篩選高活性、高溶解度鹵化酶的體內連續進化策略，以實現鹵化化合物的大規模可持續生物製造。
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基於氨醯‑tRNA合成酶的生物感測器用於體內鹵化活性檢測
研究 利用已報道的嵌合氨醯‑tRNA合成酶ChPheRS‑4（可特異性識別7‑Cl‑Trp並將其摻入蛋白質琥珀終止密碼子TAG位點），構建了鹵化活性生物感測器。將sfGFP基因第151位引入TAG終止密碼子（GFP‑151‑TAG），只有當細胞內存在7‑Cl‑Trp時，ChPheRS‑4才能介導TAG通讀，產生全長sfGFP並發出熒光（圖1A）。通過引入文獻中的兩個改進突變（aaRS的S333C和tRNA的3C1128），顯著提高了琥珀抑制效率。比較五種不同培養基，發現DRM與M9以1:9混合時，在保證低滲漏的同時獲得最高GFP信號（圖1B、1C）。該感測器在30°C下可檢測低至1 μM的7‑Cl‑Trp（信噪比9倍），最高線性範圍125‑250 μM（信噪比95倍）。加入外源色氨酸會競爭性抑制感測器，說明該aaRS對非鹵化底物無混雜性。在34°C和37°C時琥珀抑制效率下降，但無外源7‑Cl‑Trp時仍無背景信號（圖1D）。將RebH與黃素還原酶Fre共表達後，細胞內產生的7‑Cl‑Trp能驅動GFP信號達到與外源添加相當的水平，而對照（MBP替代RebH）無信號（圖1E）。該感測器為鹵化酶活性的高通量體內評估提供了可靠工具。
圖 1：基於氨醯‑tRNA合成酶（AARS）的生物感測器及鹵化生物合成迴路。
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依賴於鹵化活性的噬菌體傳播系統
為實現噬菌體輔助連續進化（PACE），將上述感測器的GFP讀出示改造為M13噬菌體繁殖依賴的信號。將RebH基因置於噬菌體基因組中（替代pIII基因），同時在宿主細胞內通過兩個輔助質粒提供：質粒1表達ChPheRS‑4（含S333C）及其同源tRNA；質粒2表達Fre以及一個在第29位含有TAG終止密碼子的pIII基因（pIII‑TAG29）（圖2A）。只有當噬菌體表達的RebH催化生成7‑Cl‑Trp並被aaRS摻入pIII蛋白中，pIII才能被翻譯，從而支持噬菌體擴增。噬菌體斑塊實驗證實，攜帶RebH的噬菌體可在不外加7‑Cl‑Trp時形成斑塊，而空噬菌體（無RebH）僅在添加7‑Cl‑Trp時才能繁殖（圖2B）。溫度依賴性實驗顯示，在30°C下，RebH噬菌體可高效繁殖；34°C時繁殖受限但仍可檢測；37°C時僅外加7‑Cl‑Trp才能繁殖（圖2C）。該結果為在34°C起始溫度下對RebH進行PACE進化奠定了基礎。
圖 2：基於M13噬菌體的鹵化酶基因迴路。
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噬菌體輔助連續進化RebH
研究 對RebH進行了總計560小時的連續流動進化，分為三個階段（圖3A）。第一階段：以野生型RebH為起點，在34°C啟動，利用攜帶誘變質粒MP6的宿主實現體內持續突變，並逐漸將溫度升至37°C以篩選熱穩定性變體。運行240小時後，對24個克隆噬菌體測序，發現兩個共同固定突變V256I和T385I（>50%頻率），另有T348A、M430L、L188F、L380F等未固定。將V256I、T385I與T348A、M430L組合獲得四突變體RebHEvo1，GFP信號顯著提高（圖3C、3D）。第二階段：以 RebHEvo1 為模板構建易錯PCR文庫，進化120小時後測序40個克隆，未出現固定突變，但富集了D101N、A16S、A32V、A50T、T496R等突變，且多個獨立克隆在空間相近位置出現突變（如D101N與G102S，T496R與Q494K）。通過組合篩選獲得包含7個突變的 RebHEvo2 ，再進一步加入Q494K、T496R等表面電荷突變和L233M，得到10個突變的 RebHEvo3 ，活性最高。第三階段：以 RebHEvo3 為模板再次文庫進化200小時，獲得一個固定突變P416S及其他富集突變，最終組合12個突變（A16S、A32V、D101N、V256I、Q323H、N326K、T348A、T385I、P416S、M430L、Q494K、T496R），命名為 RebHEvo4 ，其GFP信號比野生型提高5倍（圖3D）。結構分析顯示，突變分布在蛋白表面、內部及黃素結合口袋附近（圖3E）。
圖 3：RebH鹵化酶的噬菌體輔助連續進化（PACE）。
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進化變體RebHEvo4比野生型更可溶且活性更高
研究 在Δ tnaA菌株中表達RebHEvo4與Fre，以全細胞催化方式測定7‑鹵代色氨酸產量。在37°C下，RebHEvo4生產7‑Cl‑Trp的產量比野生型提高37倍，生產7‑Br‑Trp提高44倍；即便將野生型置於其最適溫度30°C，RebHEvo4 在37°C下的產量仍高12倍（氯代）和11倍（溴代）（圖4A、4B）。SDS‑PAGE顯示RebHEvo4 的可溶性組分遠高於野生型（圖4C）。體外純酶動力學測定表明，在飽和色氨酸條件下，RebHEvo4 的表觀 k cat 比野生型提高約2.5倍（氯化和溴化均在30°C和37°C下），說明催化效率本身也得到改善。區域選擇性未改變，仍專一在C7位鹵化。將Fre與RebH通過L3 linker融合表達可進一步提高活性（野生型和Evo4分別提高1.5倍和1.7倍），表明存在底物通道效應（圖4D）。與兩個前期報道的體外熱穩定性變體（3‑LR和3‑LSR）相比，RebHEvo4 在體內活性遠優於它們。在優化aaRS（引入M490L）後，RebHEvo4 在37°C下可實現含單個TAG的sfGFP 100%琥珀抑制，含三個TAG時達20%抑制，而野生型僅22%（單TAG）。質譜證實sfGFP正確摻入了7‑Cl‑Trp和7‑Br‑Trp（圖4E）。綜上，RebH Evo4 兼具高溶解度、高催化活性和高溫適應性。
圖 4：進化鹵化酶RebHEvo4的表徵。
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利用RebHEvo4高效生產鹵化生物分子和肽
研究首先將RebHEvo4與色氨酸脫羧酶RgnTDC在同一個細胞內共表達，構建從色氨酸到鹵化色胺的完整代謝途徑。在全細胞催化條件下，RebHEvo4使7‑氯色胺和7‑溴色胺的產量分別比野生型提高24倍和36倍（圖5A），表明該酶的改進可推廣至非天然產物。隨後在5 L補料分批生物反應器中，採用誘導型啟動子（proK‑lacO）控制Fre‑RebHEvo4表達，以相對溶氧控制補料，在37°C下約30小時獲得2.7 g/L（約12 mM）的7‑Cl‑Trp（圖5B），為目前報道的最高發酵滴度。進一步將RebHEvo4應用於抗菌肽（AMP）的位點特異性鹵化。設計了一種「自殺」篩選體系，將編碼AMP的基因中特定色氨酸密碼子改為TAG，在鹵化酶和aaRS存在下，只有正確摻入7‑Cl‑Trp的全長AMP才能抑制宿主生長（圖5C）。以Enterocin RJ‑11為模型，分別對其三個色氨酸（W12、W30、W38）進行氯代修飾，發現W30氯代變體保持與野生型相當的抑菌活性（圖5D、5E）。隨後利用SUMO融合表達系統，在E. coli中生產了Trp30‑氯代的Enterocin RJ‑11，經純化和質譜確認正確修飾（圖5F、5G）。膜完整性熒光顯微鏡實驗證實，生物合成的氯代肽與化學合成對照具有相同的膜損傷機制（圖5H）。該工作展示了利用進化鹵化酶無需外源添加昂貴非天然氨基酸，即可實現活性鹵化肽的體內篩選和規模化生物製造。
圖 5：鹵化生物分子及鹵化抗菌肽的生物製造。
本研究針對色氨酸鹵化酶RebH溶解性差、活性低、溫度敏感等瓶頸，開發了基於氨醯‑tRNA合成酶的生物感測器，並利用噬菌體輔助連續進化（PACE）技術，經過560小時定向進化獲得含12個突變的變體RebHEvo4。該變體在37°C下催化7‑氯色氨酸和7‑溴色氨酸的產量分別較野生型提高37倍和44倍，且溶解度顯著提升。在5 L生物反應器中實現了2.7 g/L的7‑氯色氨酸發酵生產，為目前最高報道水平。將RebHEvo4與脫羧酶偶聯可高效生產鹵化色胺，並首次實現了抗菌肽的位點特異性鹵化修飾及無需外源非天然氨基酸的體內生物合成。該工作為綠色生物製造鹵化藥物和肽類提供了高效酶工具。
https://www.nature.com/articles/s41467-026-70981-4
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