類胡蘿蔔素影，響柑橘的氧化還原狀態、澱粉代謝和類黃酮積累特點

類胡蘿蔔素是不可缺少的植物次生代謝產物，參與光合作用、抗氧化和植物激素生物合成。類胡蘿蔔素可能參與其他尚未發現的生物學功能。在這項研究中，我們整合了基因組、生化和細胞研究，以深入了解柑橘愈傷組織過表達 CrtB（來自泛托亞附聚體的八氫番茄紅素合酶）中類胡蘿蔔素相關的生物過程。

轉錄組學分析為類胡蘿蔔素相關的氧化還原狀態、澱粉代謝和類黃酮/花青素積累的生物學過程提供了深入的見解。通過應用生化和細胞學分析，我們確定改變的氧化還原狀態與O的變化有關2 -和 H2O2水平。我們還確定富含類胡蘿蔔素的愈傷組織中澱粉積累的減少。此外，研究富含花青素的馬齒莧愈傷組織表明類胡蘿蔔素對花青素積累有負面影響。

類胡蘿蔔素在1多億年前首次出現在細菌中，屬於所有生物中常見的異戊二烯亞科。在自然界中，類胡蘿蔔素起源於香葉基香葉基焦磷酸鹽（GGPP）的縮合反應，該焦磷酸酯是通過質體定位的4-C-甲基-D-赤蘚糖醇2-磷酸（MEP）途徑合成異戊二烯前體。

在關鍵的速率控制步驟中，八氫番茄紅素合酶（PSY）介導GGPP的縮合，形成第一個類胡蘿蔔素八氫番茄紅素。隨後，通過各種合成途徑產生不同類型的類胡蘿蔔素，包括去飽和、異構化、環化、羥基化和其他修飾。

類胡蘿蔔素及其衍生物起著重要的生理和生態作用。它們參與植物生長、發育和繁殖中的光合裝置、光保護色素、抗氧化劑、激素前體和傳粉媒介引誘劑。類胡蘿蔔素是植物激素的前體，如脫落酸、獨腳內酯和最近發現的羧內酯，可負調節植物腋窩生長。拉梅爾等人最近發現，源自β-胡蘿蔔素和活性氧（ROS）之間反應的類胡蘿蔔素內過氧化物可以作為應激信號，介導擬南芥中單線態氧的基因反應。

此外，在類胡蘿蔔素工程馬鈴薯塊莖中觀察到對內源性致胡蘿蔔素基因表達的上位影響，這表明類胡蘿蔔素代謝物存在反饋調節。可以合理地假設，還有更多與類胡蘿蔔素或其衍生物相關的生物學功能正在等待被發現。

由於類胡蘿蔔素的健康促進功能，研究類胡蘿蔔素在植物中的生物合成和積累一直是主要關注的焦點。然而，關於類胡蘿蔔素代謝對其他植物過程的影響的知識仍然相對有限。在自然系統中，例如在柑橘和番茄的果實中，類胡蘿蔔素的生物合成和積累通常與成熟過程同時發生。可以肯定的是，成熟過程涉及與代謝網路和細胞器修飾相關的細胞活動，最終決定產品質量。

除了對果實品質起作用外，一些代謝產物，如蘋果酸和花青素，還新發現了與調節果實代謝、發育和貨架期相關的生理功能。Fraser等人發現了增強類胡蘿蔔素積累對番茄果實中異戊二烯、質體發育和中間代謝的影響。在對類胡蘿蔔素積累的柑橘突變體的研究中，發現一些與碳水化合物代謝和氧化應激相關的生物學過程與野生型不同。關於類胡蘿蔔素積累計劃如何導致這些意外的代謝變化，人們知之甚少。

發色體形成是富含類胡蘿蔔素的植物組織成熟過程中最重要的細胞變化之一;它涉及顯著的類胡蘿蔔素隔離和使用其他代謝途徑，這些途徑對農產品的營養和感官質量都至關重要[17]。染色質體通常來源於先前存在的質體，如支鏈澱粉或葉綠體，染色體轉變通常與組織和器官發育有關。

在發色體發育過程中，形成質體球和類胡蘿蔔素晶體，發生澱粉分解，澱粉顆粒和類囊體消失，萜類化合物和脂質的代謝大大增強。迄今為止，對染色體發育程序如何建立的理解有限，包括代謝變異和結構重塑在內的關聯內部系統仍然表現出複雜的行為。

此外，在煙草花蜜和胡蘿蔔根中，類胡蘿蔔素積累與澱粉顆粒發育之間的相互排斥關係表明，增強的胡蘿蔔素生成是指導從支鏈澱粉向發色體轉變的發育信號。此外，先前在類胡蘿蔔素工程植物中觀察到色質體形態的改變，這表明細胞結構有可能適應以促進新形成的類胡蘿蔔素的隔離。

除了類胡蘿蔔素的生物合成外，花青素的積累是一些水果成熟過程中的重要生物事件。花青素是植物酚類次生代謝產物，是苯丙烷途徑的一部分。與類胡蘿蔔素一樣，它們參與一系列關鍵的生物過程，如抗氧化保護和生殖引誘劑的產生，它們對於保護人類健康也是必不可少的。花青素可以與植物組織和器官中的類胡蘿蔔素共存，但在一些富含類胡蘿蔔素的器官中，花青素積累相對較少。在高爾拉姆齊花和番茄果實中觀察到這種現象。

目前尚不清楚類胡蘿蔔素和花青素之間是否存在負相關關係，這是一個很難回答的問題。類胡蘿蔔素和花青素通常參與伴隨自然發育的並行生物合成過程，這使得定義因果關係變得困難。對於其他假設的類胡蘿蔔素相關生物過程也進行了類似的觀察。

最近，遺傳操作已成功用於許多植物，以修飾胡蘿蔔素生成和其他質量相關成分。在這些具有靶向代謝途徑修飾的工程植物中，發生了各種意想不到的生理、生化和細胞變化。工程系統似乎為調節給定代謝物的積累提供了一種有效的方法，並且它們有助於識別結合生物學關係。

ECM 轉錄模式

通過柑橘胚性愈傷組織中過表達35S：：CrtB產生的工程細胞模型（ECM）顯示出類胡蘿蔔素的驚人積累。然而，對與工程類胡蘿蔔素積累相關的其他生物過程知之甚少。因此，為了進一步理解細胞對增強類胡蘿蔔素生物合成的反應，我們使用了三種代表性的ECM及其在Affymetrix微陣列分析中的野生類型。

確定了上調或下調超過2倍（ECM/WTs，P<0.05）的基因，但M-1/WT數據中的基因使用了5.0倍的寬鬆閾值（ECM/WTs，P<05.33）。之所以使用這種寬鬆的閾值，是因為M-33與其野生型之間相對缺乏差異表達基因，這很可能是由於沼澤葡萄柚基因型中類胡蘿蔔素積累的強烈適應。

為了驗證微陣列數據，對三種具有代表性的ECM及其野生型進行了定量實時PCR（qRT-PCR）實驗。共選擇10個基因，設計基因特異性引物。線性回歸分析顯示總體相關係數為R 2qRT-PCR 和微陣列數據之間的 = 0.6605，這證實了微陣列數據是可靠的。

此外，基因注釋顯示，在1個ECM中，大量上調基因被注釋為編碼過氧化物酶（POD）、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）和富含羥脯氨酸的糖蛋白家族蛋白。下調基因主要編碼蛋白激酶、鋅指家族蛋白、富含甘氨酸的蛋白和衰老相關因子。

ECM中的氧化還原狀態發生了顯著變化

POD、GST、富含羥脯氨酸的糖蛋白家族蛋白、熱休克蛋白和USP家族蛋白通常被認為是植物中重要的脅迫反應因子。有趣的是，我們的微陣列顯示，這些與應激相關的基因，尤其是POD，在ECM中被顯著誘導。

對亞細胞定位和差異表達POD類別的預測表明它們是細胞外III類過氧化物酶。工程化類胡蘿蔔素修飾會干擾ABA水平，這可能與ECM中觀察到的應激和氧化還原反應有關。然而，比較分析表明，與相應的野生型相比，ABA含量僅在RB ECM中較高，而在M和SBT ECM中則比較高。

此外，通過愈傷組織中的RT-PCR分析驗證了微陣列數據中的幾個差異表達基因，這些基因包括WRKY75，蛋白酶抑製劑基因，富含羥脯氨酸的糖蛋白家族蛋白基因和USP家族蛋白基因。因此，我們研究了愈傷組織中的ROS水平。NBT染色顯示超氧自由基（O2 -）與野生類型相比，ECM中的水平顯著降低。相比之下，過氧化氫（H2O2）水平顯示出意外的增加。這一結果證實了微陣列數據，該數據揭示了許多應激和氧化還原反應基因被上調;H2O2在應激反應中具有信號傳導作用。

類胡蘿蔔素積累改變了ECM中的澱粉代謝

α-澱粉酶基因的明確誘導及其酶活性升高表明ECM中澱粉代謝的修飾。這為解釋在ECM中觀察到的一些現象提供了關鍵線索。例如，它們通常具有減少的乾重，並且它們的細胞學譜通常顯示比野生類型更少的澱粉顆粒。

因此，我們研究了愈傷組織中的澱粉水平。與相應的野生類型相比，ECMs的澱粉含量降低，這與碘染色的結果一致。此外，我們分離了澱粉顆粒，並注意到野生類型中的澱粉顆粒比ECM中的澱粉顆粒多得多。隨後的SEM研究表明，ECM細胞中沒有大的澱粉顆粒。我們還發現ECM在ECM中具有較高的可溶性糖（果糖，葡萄糖和蔗糖）含量，這表明ECM中澱粉代謝的生化改變。

澱粉含量降低與柑橘中類胡蘿蔔素的顯著積累同時發生

我們通過在早開花的柑橘親戚香港金橘中過表達35S：：CrtB來產生轉基因植物。CrtB基因的過表達導致花瓣，根和其他組織的橙色色素沉著，這表明類胡蘿蔔素積累增加。使用光學和電子顯微鏡的細胞檢查顯示橙色組織中質體的顯著改變，這導致先前存在的質體顯示出色質體樣特徵。例如，在野生型組織中，在花和深色生長的根中發現支鏈澱粉，在深色生長的胚狀體中發現乙粒體，在老葉柄和光生長的根中發現葉綠體，所有這些質體都顯示出顯著的澱粉顆粒沉積。

類黃酮/花青素的生物合成受到類胡蘿蔔素積累的負面影響

在ECM中，與次級代謝相關的轉錄變化是明顯的。特別是類黃酮/花青素生物合成基因的轉錄在ECM中受到抑制。此外，我們還測試了查耳酮合酶（CHS）和查耳酮異構酶（CHI）（類黃酮生物合成的關鍵酶）在轉基因金橘根部的表達及其對照。qRT-PCR分析顯示，CHS和CHI基因在轉基因金橘橙根中的表達水平均低於野生型對照。

這些結果表明，類胡蘿蔔素對類黃酮/花青素積累有負面影響。柑橘胚源愈傷組織和根不含花青素，因此很難在這些組織中研究這種表型。為了研究這種負相關關係，我們通過使用35S：：CrtB結構設計富含花青素的支原體愈傷組織來建立蘋果ECM。CrtB基因的過表達導致蘋果ECM中總類胡蘿蔔素水平增加3.68倍。

通過細胞檢查也可以觀察到豐富的類胡蘿蔔素積累，這表明蘋果ECM細胞在質體中形成許多質體球，但野生型細胞中的質體充滿了澱粉顆粒。值得注意的是，在可見光下，野生型愈傷組織含有豐富的花青素，但蘋果ECM顯示花青素積累最少。

我們對柑橘愈傷組織轉錄模式的研究將類胡蘿蔔素積累與氧化還原狀態、澱粉代謝和類黃酮/花青素積累聯繫起來。這些生理過程的存在通過生化和細胞學分析以及柑橘愈傷組織、辛德斯溫格爾纖維和胡佩亨斯猂蟬中類胡蘿蔔素生物合成的遺傳操作進一步闡明。我們的研究結果為類胡蘿蔔素積累的複雜性及其相關的生物過程提供了新的視角。

例如，我們證實，大量的類胡蘿蔔素積累會導致愈傷組織系統和花瓣和根部等組織中的澱粉降解。這些模型系統產生的數據提供了重要的信息，可以促進對其他植物系統成熟過程中澱粉代謝和類胡蘿蔔素積累的理解。同樣重要的是，我們的發現通過提供密切考慮更廣泛的特徵（如植物抗性和系統代謝修飾）所需的知識，對類胡蘿蔔素代謝工程具有重大意義。

特別是，在類胡蘿蔔素代謝工程植物中，應避免與類胡蘿蔔素積累相關的花青素水平降低。花青素是親水性膳食抗氧化劑的重要來源，富含可溶性和親脂性抗氧化劑的水果和蔬菜被認為提供最佳的健康保護。