四維(4D)列印是增材製造中的一個新興領域，這項技術有助於開發電子、生物醫學、機器人和其他領域的高要求產品。目前，大多數報道的4D印刷系統是基於印刷對象的時間形狀變換。除了形狀之外，函數的時間異質性的誘導可以擴展4D印刷的範圍。為此，來自上海交通大學的王瑾曄教授團隊報道了一種4D列印方法，該方法使用了受澱粉樣纖維形成機制啟發的植物蛋白(玉米蛋白)凝膠（圖1）。在這項研究中，玉米醇溶蛋白凝膠應用於添加製造，以生產具有可控特性的支架，同時研究了玉米醇溶蛋白溶液的凝膠化機理。相關研究成果以「Water-responsive 4D printing based on self-assembly of hydrophobic protein 「Zein」 for the control of degradation rate and drug release」為題於2022年11月25日發表在《Bioact. Mater.》上。
圖1 基於疏水蛋白「玉米醇溶蛋白」的4D列印
- 玉米醇溶蛋白凝膠的製備及結構表徵
玉米醇溶蛋白溶液的凝膠化機理受到澱粉樣原纖維的啟發，氫鍵驅動原纖維形成凝膠網路，作者使用冷凍-TEM、FTIR和ThT結合分析進行結構表徵。玉米醇溶蛋白在水醇溶劑中溶解後形成球形自組裝體(圖2a)，而在玉米醇溶蛋白凝膠中，觀察到最小直徑為10 nm的纖維狀網路(圖2b)。FTIR分析顯示在1625-1635 cm處有一個小肩−1表明膠凝過程中β-摺疊的形成(圖2c)。此外，從二階導數光譜中觀察到β-摺疊含量的移動，表明新的β-帶(圖2d)。與玉米醇溶蛋白凝膠的陽性ThT結合表明玉米醇溶蛋白溶液的膠凝是澱粉樣蛋白引起的(圖2f–h)。
圖2 玉米醇溶蛋白凝膠的製備及結構表徵
- 玉米醇溶蛋白凝膠的流變特性和印刷適性
接下來，作者評估了凝膠的流變性質以建立可印刷性的理論估計。凝膠在較高剪切速率下表現出低粘度的剪切變稀行為(圖3a)。應變/應力掃描曲線顯示玉米醇溶蛋白凝膠具有粘彈性，在低應變下具有比粘性模量更高的彈性模量值(圖3b)。對於所有的玉米醇溶蛋白凝膠，在經過100%應變後也觀察到了結構恢復能力，這使得印刷結構的穩定性(圖3c)。總的來說，玉米醇溶蛋白凝膠表現出適於直接列印的流變性質。此外，由於玉米醇溶蛋白凝膠由氫鍵驅動，因此擠出後可以自組裝，導致連續的絲狀凝膠擠出(圖3d-e)。同時，屈服應力和結構恢復進一步支持細絲在重力作用下不塌陷(圖3f)。
圖3 玉米醇溶蛋白凝膠的可印刷性評估
- 支持浴中玉米醇溶蛋白凝膠的4D印刷
在玉米醇溶蛋白凝膠中澱粉樣蛋白原纖維之間存在氫鍵，並且在水浸泡時，疏水相互作用佔優勢，導致凝膠固化。因此，作者對其進行了概念認證，12小時內未觀察到CB60的尺寸變化，這可能是由於玉米醇溶蛋白凝膠和支持浴之間平衡的氫和疏水相互作用。
圖4 在不同水濃度的Carbopol浴(CB75和CB40)中印刷玉米蛋白期間結構變化的機理
對於整體結構轉變，作者提出了一種機制，以雙層Carbopol支持浴(CB75/CB40)中負載染料的蝶形結構為例（圖4）。在CB75中，玉米醇溶蛋白傾向於快速自組裝，疏水吸引佔優勢，導致結構/細絲的收縮。在CB40中，由於水濃度低，玉米醇溶蛋白分子和支持介質的溶劑之間的氫鍵佔優勢，導致結構/細絲增加，形成鬆散的網路。如下視頻進一步驗證了這一點，同時也說明了支持浴玉米醇溶蛋白凝膠的4D印刷。
- 列印構建體的降解速率
通過計算在含有蛋白酶XIV的降解介質中的重量損失百分比來評估乾燥後的印刷構建體(導管狀)的降解速率。隨著支持浴中水濃度從75%降至40%,降解速率顯著降低。在CB75中印刷的導管在10天內降解了88.2±1.17%，剩餘結構的完整性喪失(塌陷)，降解過程中導管的壁厚也減少(圖5a-b)。印刷在CB75中的導管比印刷在CB40中的導管具有更高的孔隙率(圖5c)。較高的孔隙率促進了介質的滲透，從而導致更快的降解，而孔隙率較低的導管(CB40)限制了水的滲透。
此外，作者還評估了CB75-CB40-CB75三段導管作為大鼠坐骨神經損傷模型中的神經導管(15 mm)的降解速率(圖5e)。CB75-CB40-CB75導管顯示出較快的末端降解，這是由於存在高多孔CB75部分，而中間部分降解緩慢(CB40) (圖5f)。導管的近端部分比遠端部分降解更快，這是因為近端部分的神經再生更快。相反，在CB40-CB75-CB40導管中，中間部分(CB75)比末端位置(CB40)降解更快(圖5g)。與之對應的HE染色進一步證明了這一點。
圖5 評估導管的降解速率
- 結構異質性應用的概念證明
為了提供結構異質性應用的概念證明，在雙層支持浴(CB75/CB40)中印刷裝載鹽酸環丙沙星(CPFX)的導管和裝載阿黴素(DOX)的蝶形構建體。CPFX是一種常用的抗生素，DOX被用作抗腫瘤劑。列印在CB75中的導管的CPFX負載和藥物釋放速率高於印刷在CB40中的導管(圖6a-b)。與CPFX一樣，觀察到在CB75中印刷的結構的DOX載入和釋放高於在CB40中印刷的速率(圖6d-e)。將該結構分成兩部分以評估裝載DOX的蝴蝶的細胞毒性，在CB75中印刷的蝴蝶內發現了對BEL7402細胞有更高的細胞毒性(圖6f)。總之，雙相控釋可能有助於實現初始快速釋放和長期持續釋放。依賴於支持浴的水濃度的不同藥物釋放可以用孔隙率來解釋。CB75中印刷的構建體的更高孔隙率通過溶解介質的容易滲透而導致更快的釋放。
圖6 結構異質性應用的證明
- 導管作為輸尿管支架在豬模型中的功效
最後，作者在豬模型中，將4D列印玉米蛋白導管用為藥物洗脫、可生物降解的輸尿管支架。在動物實驗中，作者設計了實驗來評估印刷在CB75或CB40中的載有CPFX的導管的尿液排泄和抗菌功效，以驗證差異藥物釋放(圖7a)。手術前，靜脈注射碘海醇3 min後，觀察到腎盂、腎盞和輸尿管，表明分泌和排泄功能正常。腎盂和輸尿管中的造影劑在注射後30分鐘消失(圖7b)。術後4天，注射後3分鐘出現腎盂和輸尿管，腎盂和輸尿管沒有擴張，表明分泌和排泄良好。造影劑穿過支架植入部位。注射後60分鐘，腎盂和輸尿管中的造影劑消失(圖7b)。此外，CFUs計數測試顯示，在CB75中印刷的支架比在CB40中印刷的支架具有顯著更高的CFUs(圖7c)。總的來說，玉米蛋白支架顯示動物模型中尿液引流功效和抗菌活性，可用於製備4D列印藥物洗脫可生物降解輸尿管支架。
圖7 豬模型中列印導管作為輸尿管支架的應用
綜上，本文將玉米醇溶蛋白凝膠應用於添加製造，以生產具有可控特性的支架。作者發現氫鍵結合的澱粉樣原纖維是剪切應力下玉米醇溶蛋白凝膠形成的原因。玉米醇溶蛋白凝膠具有水誘導的自組裝特性，該特性被開發用於使用特製支持浴的4D印刷。疏水吸引在不同水濃度的支持浴中引起不同的自組裝。疏水性自組裝的顯示出可控的印刷結構性質，特別是對於生物醫學目的，並且提供了可調的藥物負載、藥物釋放和降解速率。動物研究進一步驗證了這種4D列印結構的顯著翻譯潛力，同時這個原理可以進一步擴展到其他材料的4D印刷。
文章來源：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.11.009
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