傷口癒合是一個複雜的生物過程，涉及到各種細胞類型之間密切的相互作用。慢性非癒合性傷口，如糖尿病性傷口，表現為癒合失調。它們表現為延長的炎症期，並未能過渡到增殖期，從而誘導持續炎症。此外，糖尿病創面微環境中的細胞表現出促細胞因子和抗炎細胞因子的失調，血管生成受損。具體來說，糖尿病創面內的成纖維細胞表現出不需要的表型和行為，其標誌是ECM合成減少、增殖和遷移能力下降。
為了解決這一問題，來自英國諾丁漢大學的Amir M Ghaemmaghami團隊通過開發活性生物誘導基質細胞誘導材料來積極調節成纖維細胞的表型和行為，進而促進糖尿病創面癒合。通過對一系列表面化學物質的篩選，作者發現了pTHFuA(促增殖聚合物)，並首次成功地利用表現活性單體修飾微粒，在體內傳遞具有生物指導性的聚合物。
相關研究成果以「Microparticles decorated with cell-instructive surface chemistries actively promote wound healing」為題於2022年11月28日發表在《Adv. Mater.》上。
- 發現成纖維細胞指導聚合物
對於促進傷口癒合的材料，化學線索必須指導成纖維細胞附著、擴散和增殖，同時控制向肌成纖維細胞的分化。成纖維細胞呈圓形，表明其擴散不足，從而阻礙了細胞功能。成纖維細胞在聚合物上的大小也在5–175%之間(圖1a)。為了了解聚合物對成纖維細胞增殖和分化的影響，作者繪製了增殖指數和α-SMA表達(相對於TCP)的倍數變化，這使得相對於TCP控制的聚合物的表型調節能力得以可視化（圖1b）。增殖和分化都是決定傷口癒合結果的關鍵表型性狀。α-SMA作為成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的標記物，在本研究中被用作成纖維細胞行為的替代物。肌成纖維細胞是參與傷口癒合的關鍵細胞類型，它的持續存在與疤痕癒合有關。
此外，從高通量篩選中選擇pTHFuA和pEGPEA是因為a)它們的變異係數(COV)低，因此重複性高，b)它們可以使用熱自由基聚合聚合，c)它們可以合成表面活性劑製備微粒(即去除固有交聯的聚合物)。因此，增殖指數或α-SMA表達發生更高倍變化的聚合物表示無法合成表面活性劑，因此無法合成微粒和/或COV較高，降低了重現性。因此，作者將pTHFuA指定為增增殖聚合物，把pEGPEA指定為抗增殖聚合物。
圖1 發現調節成纖維細胞表型的聚合物
作者對抗增殖和增殖聚合物表面的傷口閉合進行了劃痕試驗。48小時後，促增殖表面的成纖維細胞侵蝕了48%的初始「傷口」區域，而抗增殖表面的這一比例為35%(圖1d和e)。在96小時時，促增殖表面的傷口閉合率為82%，而抗增殖表面的閉合率為55%。這一觀察顯示了促增殖聚合物的功能能力，加速成纖維細胞增殖和遷移，帶來傷口癒合。
- 微粒的製造與表徵
具有促增殖和抗增殖表面化學作用的聚合物微粒被用於在傷口環境中刺激具有生物指導性的基質細胞壁龕。微粒是用液滴微流控工藝製成的，以達到均勻的顆粒大小。作者通過合成THFuA -共聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯(mPEGMA)和EGPEA-co-mPEGMA聚合物分別作為促增殖和抗增殖的表面活性劑。用於生產微粒的核心材料是1,6己二醇雙丙烯酸酯，使微粒不可降解。這種更簡單的非可吸收系統可以在體內實驗中不存在生物吸附的複雜性的情況下研究表面化學的生物指導潛力。
為了研究表面，使用掃描電子顯微鏡(SEM)和飛行時間-二次離子質譜(ToF-SIMS)對微粒進行了表徵（圖2）。不含沖劑的顆粒變化最大，為4.8%，與不存在表面活性劑穩定界面相一致。添加了表面活性劑的微粒的COV為3.4% (THFuA-co-mPEGMA)和3.0% (EGPEA-co-mPEGMA)，表明與不添加表面活性劑的微粒相比，表面活性劑能有效穩定微粒表面。
圖2 微粒的製造與表徵
- 生物指導性微粒促進創面癒合成纖維細胞表型
接著，通過測定細胞總DNA含量來研究成纖維細胞在被膜微粒上的粘附和活性。研究顯示，促增殖和抗增殖微粒都支持較高的細胞活力。通過測量培養24-96小時內細胞數量的增加來研究成纖維細胞的增殖(圖3a)。與抗增殖微粒相比，促增殖微粒附著成纖維細胞的數量增加了約3倍(增加1.5倍)。為了進一步表徵成纖維細胞的功能反應，用qPCR方法研究了促增殖和抗增殖微粒培養的細胞中ECM標記ⅰ型膠原(α1)和ⅲ型膠原(α1)的基因表達。這是由於成纖維細胞是參與這兩種標記物表達的主要細胞類型。在抗增殖微粒上培養的成纖維細胞，I型膠原蛋白和III型膠原蛋白均上調，基因表達分別上調了7.1倍和13.5倍(圖3c)。
圖3 致傷微粒上成纖維細胞的功能行為和表型
- 促增殖和抗增殖微粒在體內影響糖尿病創面癒合
將糖尿病小鼠側側全層切除皮膚傷口在接受促增殖和抗增殖功能化顆粒治療後的癒合情況與未接受治療的傷口進行比較(圖4a)。雖然所有的創面面積都隨著時間的推移而減小，但應用增殖微粒以更快的速度減小創面面積(圖4d)。與促增殖微粒分布相反，H&E染色(圖4b)揭示了傷口空洞內的抗增殖微粒是如何消散到傷口兩側的，在那裡可以看到肉芽組織，創面床的中心部分幾乎沒有肉芽組織深度(GTD)和免疫細胞浸潤(圖4d和e)。Masson染色(圖4c)和隨後的膠原蛋白厚度分析(圖4e)顯示，與抗增殖顆粒和未處理的傷口相比，在糖尿病傷口中添加促增殖微粒導致膠原蛋白生成增加，改善癒合和再生。
圖4 從暴露於抗增殖(pEGPEA)和促增殖(pTHFuA)微粒的糖尿病小鼠全層傷口中提取組織學結果
此外，細胞增殖免疫染色顯示，與抗增殖創面(p<0.0001)和未處理創面(p<0.0001)相比，增增殖微粒處理的創面有更多的BrdU陽性細胞(圖4h)， I型膠原蛋白表達更高(圖5a)。所有傷口的膠原蛋白III水平相似(圖5b)，這表明促增殖顆粒處理的創面內形成的肉芽組織主要由I型膠原蛋白和III型膠原蛋白組成，從而上調了I/III型膠原蛋白的比例，這與促進小鼠糖尿病創面癒合有關。
圖5 用抗增殖(pEGPEA)和促增殖(pTHFuA)微粒處理的糖尿病小鼠切除組織的免疫熒光染色
綜上，利用活性生物指導微粒引導成纖維細胞功能表型的策略是利用這些細胞的重構潛力的一種新方法，它具有明顯的促增殖和抗增殖表型和行為。通過對一系列表面化學物質的篩選，作者發現了pTHFuA(促增殖聚合物)，並首次成功地利用表面活性方法修飾微粒，在體內傳遞具有生物指導性的聚合物。與pEGPEA(抗增殖聚合物)包被微粒和未處理的傷口相比，促增殖微粒顯著促進傷口癒合和組織肉芽化。這項研究結果為活性非洗脫免疫誘導聚合物(pTHFuA)的適用性提供了新的見解，pTHFuA支持糖尿病傷口癒合，並有可能轉化為臨床治療糖尿病傷口、潛在燒傷和其他類型的慢性或急性傷口。
文章來源：https://doi.org/10.1002/adma.202208364
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