遺傳密碼的錯誤翻譯，稱為誤譯，在傳統上被認為是不利於細胞生長和生存的。但已證明生物故意錯誤翻譯遺傳密碼以應對壓力，且越來越多的證據表明，許多微生物病原體可以故意錯誤翻譯其遺傳密碼，以幫助入侵宿主或逃避宿主的免疫反應，已在越來越多的微生物病原體中發現了錯誤翻譯。這種故意錯誤翻譯不是隨機的，通常是僅限於一種特定類型的翻譯錯誤，這種錯誤是由於存在一種不尋常的、專用的蛋白質合成因子，賦予生物體故意改變遺傳密碼規則的能力。由於缺乏識別自然界中異常翻譯因子的通用策略，使病原生物中錯誤翻譯的研究受到阻礙。
最近報道的研究中，作者通過研究編碼氨醯-tRNA合成酶（aaRS）基因的副本以發現故意錯誤翻譯，從而解決了上述問題，該成果發表於《PNAS》。
植物病原性鏈黴菌編碼不尋常的ProRS亞型
在細菌中，脯氨醯-tRNA合成酶（ProRS）有兩種亞型，它們執行相同的基本功能，但具有不同的結構和結構域排列。但最近，人們發現了第三種ProRS，命名為ProRSx。通過BLAST比對發現，ProRSx主要出現在4個鏈黴菌屬中，但它們都對幾種農作物構成威脅，主要是馬鈴薯。在蛋白結構上，ProRSx與細菌型ProRS具有相同的結構域組織，這表明ProRSx可能是通過鏈黴菌中細菌型ProRS基因的複製進化而來的。然而，ProRSx序列與細菌型ProRS又存在顯著差異，尤其是識別tRNAPro反義密碼子的C端結構域，缺乏細菌型ProRS特徵基序（圖1B）。
ProRSx的兩側是具有多種特徵元素的不尋常脯氨酸tRNA基因
為了深入了解ProRSx的可能功能，作者分析了鏈黴菌屬物種中ProRSx基因的基因組背景。有趣的是，作者發現ProRSx由一個保守的操縱子編碼，並且包括一個與ProRSx相鄰的tRNA基因。作者對該tRNA基因的二級結構進行預測分析（圖3A），發現該tRNA具有高度非典型結構。它具有丙氨酸反密碼子AGC，但它缺少tRNAAla特有的G3:U70鹼基對，卻有脯氨酸tRNA特徵元件C1:G72鹼基對。由於混合了這些特徵元素，作者將tRNA該命名為tRNAProA。因為tRNAProA混合多種特徵，作者接下來測試了tRNAProA是否可以與典型的ProRS或AlaRS發生交叉反應。使用體外氨醯化實驗表明，典型的ProRS或AlaRS無法氨醯化tRNAProA。這些數據以及tRNAProA和ProRSx基因的共定位表明tRNAProA只是ProRSx底物。
在大腸桿菌中共表達S.turgidiscabies的ProRSx和tRNAProA導致丙氨酸錯譯成脯氨酸
為進一步研究研究S.turgidiscabies ProRSs在細菌中的功能活性，作者接下來建立了一個溫度敏感實驗方案。作者採用溫度敏感型的大腸桿菌菌株UQ27,其ProRS在42°C下將失活，細菌將會死亡，但能被攜帶完整功能ProRS基因的質粒補救。實驗結果表明，在42°C下，ProRSx無法補救UQ27菌株，即ProRSx無法氨醯化大腸桿菌中的tRNAPro。作者接下來試圖直接在體外測試tRNAProA是否可以被ProRSx氨醯化。但在原核表達的過程中ProRSx形成包涵體，因而無法獲得有活性的ProRSx。為了解決這個問題，作者開發了一種高度敏感的替代方案來測定大腸桿菌細胞中的ProRSx和tRNAProA活性。該測定方法基於β-內醯胺酶報告基因，若其第65位保守的Pro殘基替換為Ala會大大削弱β-內醯胺酶的活性，因此可以用於監測GCU丙氨酸密碼子與脯氨酸的錯誤翻譯（Ala→Pro錯誤翻譯）（圖4A）。實驗結果表明，ProRSx可以用脯氨酸氨醯化tRNAProA，導致用脯氨酸解碼GCU丙氨酸密碼子。
ProRS-Ec-5ABD對tRNAProA的體內氨基醯化導致丙氨酸密碼子的錯誤翻譯
作者接下來試圖了解tRNAProA如何避免與典型的ProRS發生交叉反應，但仍對ProRSx保持特異性。
在T.thermophilus中，ProRS識別tRNAPro主要依賴於K353,D354,E340,R347和K369五個保守殘基，但在ProRSx中均發生突變。因此，作者根據ProRSx的序列將大腸桿菌的ProRS進行點突變，獲得大腸桿菌ProRS(ProRS-Ec-5ABD)的突變體。實驗結果發現，ProRS-Ec-5ABD保留了大腸桿菌的氨醯化典型tRNAPro的能力，同時還獲得了用脯氨酸氨醯化tRNAProA的能力（圖5C和D）。
為了便於定量，作者建立了一個檢測方案，該方案基於綠色熒光蛋白GFP和紅色熒光蛋白mCherry之間的嵌合蛋白融合（圖6A）。前人的研究表明，用脯氨酸替代第65位的絲氨酸會削弱GFP熒光，但用丙氨酸替代則會產生有熒光的GFP。因此可以通過比較GFP和mCherry熒光強弱即可判斷是否發生錯誤翻譯。通過質譜分析表明，表達ProRS-Ec-5ABD和tRNAProA的細胞在GFP/mCherry報告蛋白中確實含有Ala→Pro突變（在GFP位置65）。相比之下，在不表達tRNAProA的情況下表達ProRS-Ec5ABD的細胞僅包含野生型的GFP（圖6D）。
ProRS-Ec-5ABD和tRNAProA的錯誤翻譯抑制細胞生長
最後，作者使用ProRS-Ec-5ABD來評估蛋白質組範圍內丙氨酸密碼子的錯誤翻譯如何影響細菌適應性。作者觀察到，當單獨表達tRNAProA或ProRS-Ec-5ADB都對大腸桿菌的生長沒有毒性。然而，當tRNAProA和ProRS-Ec-5ADB同時表達時，大腸桿菌的生長明顯受到抑制，這進一步表明兩者可能是共同進化的產物。
總結
作者以細菌脯氨醯-tRNA合成酶(ProRS)基因為例，鑒定了一種異常的ProRS亞型ProRSx和相應的tRNA--tRNAProA，它們主要存在於來自鏈黴菌屬的植物病原體中。然後作者發現tRNAProA具有不尋常的混合結構，允許此tRNA將丙氨酸密碼子錯誤翻譯為脯氨酸。最後，作者提供了生化、遺傳和質譜證據，表明表達ProRSx和tRNAProA的細胞可以將GCU丙氨酸密碼子翻譯為丙氨酸和脯氨酸。由於蛋白質序列中的隨機Ala→Pro突變，這種丙氨酸密碼子的雙重使用創造了隱藏的蛋白質組多樣性。這一發現揭示了天然tRNA合成酶/tRNA用於有義密碼子專用錯誤翻譯的最初例子。
原文鏈接：
https://www.pnas.org/content/118/35/e2110797118
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