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陰道炎是一種常見的陰道微生物群紊亂失調症，黴菌性和細菌性陰道炎是兩類常見陰道炎。
臨床常用治療陰道炎的廣譜抗真菌葯如甲硝唑、克林黴素對全身治療和局部治療有一定效果，但也有複發性和耐藥性等問題。
與傳統抗真菌藥物相比，中藥具有多靶點、整體調節的作用。
近年來，研究人員發現多種有抑菌活性的中藥單體(如黃芩苷、小檗鹼、苦參鹼、蛇床子素等和中藥外用製劑(如婦陰康洗劑、紅核婦潔洗液、潔爾陰洗液等)。
婦陰康洗劑主要成分為秦皮、魚腥草、苦參、仙鶴草、大青葉和紫花地丁，其主要功能為清熱燥濕、除癢止帶。
本研究通過測定婦陰康洗劑體外抑菌抗炎活性，及其對黴菌性陰道炎和細菌性陰道炎的治療作用，為臨床婦陰康洗劑的指導用藥提供依據。
材料
藥物
婦陰康洗劑濃縮液(批號200304,宿州億帆葯業有限公司),無菌純水或適宜的培養基按1∶4稀釋，即得，為臨床使用濃度。
陽性對照藥物：醋酸氯己定(批號D1201A,大連美崙生物技術有限公司);硝酸咪康唑、甲硝唑[批號B603BA0014、E515BA0003,生工生物工程(上海)股份有限公司]。
菌株
臨床株：需氧菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌各5株，由東南大學附屬醫院檢驗科分離鑒定提供；厭氧菌加德納菌5株、克氏動彎桿菌1株、二路普雷沃菌1株、捲曲乳桿菌3株由南京軍區總醫院檢驗科分離鑒定提供。
標準株：金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、白色念珠菌(ATCC 10231)、二路普雷沃菌(ATCC 29303)、克氏動彎桿菌(ATCC 35241)、捲曲乳桿菌(ATCC 33197)、詹氏乳桿菌(ATCC 25258)、惰性乳桿菌(ATCC 55195)、加德納菌(ATCC 14018),為中國藥科大學微生物教研室保存。
細胞
小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7細胞株，為中國藥科大學微生物教研室保存。
培養基
細菌培養基：MRS培養基(批號20190730)購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；營養瓊脂培養基(批號200418)、MH液體培養基(批號181116)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(批號190923)、腦-心浸萃瓊脂培養基(批號181105)、哥倫比亞血瓊脂基礎培養基(批號190117)購自北京三藥科技有限公司。
細胞培養基：DMEM培養基(批號8120334)、胎牛血清(批號1872295)購自美國Gibco公司。
試劑
IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒(批號A201B00913、A28201031)購自杭州聯科生物技術股份有限公司。
氯化鈉、碳酸氫鈉等其他試劑均為國產分析純。
動物
健康清潔級SD大鼠80隻，雌性，成熟未交配，體質量(200±20)g, 購自上海傑思儀器
台式低速離心機(型號SC-04),安徽中科中佳科學儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器(型號MLS-3781L),日本松下公司；培養箱(型號GNP-9160),上海精宏實驗設備有限公司。
最低抑菌濃度(MIC)測定
參照CLSI標準，採用平板稀釋法進行實驗。
無菌水倍比稀釋藥物後製成含葯平板。
多點接種儀蘸取相應菌懸液接種於含葯平板中(每點接種量約為1×103 CFU),並設置陽性對照和空白對照。
適宜條件下培養後，無菌生長的最低藥物濃度為其MIC值。
殺菌曲線測定
處於對數生長期的菌懸液與含相應液體培養基的藥液混合，使菌液終密度為1×105 CFU/mL,藥物終濃度為4×MIC,37 ℃培養，不同時間下吸取培養物進行梯度稀釋和菌落計數，並設置陽性對照和空白對照。
適宜條件下培養後，記錄菌落數並繪製殺菌曲線。
婦陰康洗劑對黴菌性/細菌性陰道炎模型大鼠的藥效學研究
無菌較硬的棉拭子蘸取5×106/mL白色念珠菌或1×109 CFU/mL陰道加德納菌臨床株菌液反覆塗擦雌性大鼠陰道內壁，然後注入菌液，劑量為100 μL/200 g。
每天接種1次，共7次。
首次接種後第9天，取大鼠陰道分泌物進行鏡檢、細菌培養。
感染成功的大鼠隨機分為模型組、婦陰康洗劑組、硝酸咪康唑(0.02 g/kg)組或甲硝唑(0.05 g/kg)組，未感染大鼠作為空白對照組，每組5隻。
將婦陰康洗劑濃縮液以無菌純水按1∶1、1∶2、1∶4稀釋得婦陰康洗劑高、中、低(4.4、2.2、1.1 mL/kg)劑量並注入大鼠陰道，每隻500 μL;模型組和空白對照組大鼠以等體積無菌純水進行沖洗，每天陰道給葯1次，共7 d。
停葯後第2天，收集大鼠陰道分泌物，稀釋並接種至含5%肝素鈉抗凝兔血的哥倫比亞培養基或選擇性培養乳桿菌屬的MRS培養基，37 ℃厭氧培養2～3 d以計數分泌物中加德納菌和總乳桿菌的數量。
同時取大鼠陰道組織，HE染色觀察病理變化。
婦陰康洗劑對白色念珠菌/加德納菌感染RAW 264.7細胞炎症相關因子的影響
復甦RAW 264.7細胞，加入含10% FBS的DMEM培養基，於37 ℃、5% CO2環境下培養。
取對數生長期的RAW264.7 細胞，以每孔4×105個細胞的密度接種於24孔板中，24 h後以加德納菌和白色念珠菌感染細胞(MOI=20),同時加入婦陰康洗劑、甲硝唑(200 μg/mL)、硝酸咪康唑(25 μg/mL),或等體積無菌生理鹽水為模型組，每組3個復孔，同時設置未感染細胞組為陰性對照組。
感染8 h後，收集細胞上清，ELISA法檢測細胞上清液IL-1β、TNF-α水平。
統計學分析
通過SPSS 22.0軟體進行處理，計量資料以[Math Processing Error]表示，兩組間比較採用獨立樣本t檢驗。
P< 0.05表示差異具有統計學意義。
婦陰康洗劑對細菌和真菌的MIC值
婦陰康洗劑對金黃色葡萄球菌的MIC稀釋度範圍為1/20～1/5,對錶皮葡萄球菌、大腸埃希菌的MIC稀釋度範圍為1/20～1/10,對銅綠假單胞菌的MIC稀釋度範圍為1/10～1/5。
此外對甲硝唑或咪康唑不敏感的厭氧菌、真菌，婦陰康洗劑也有一定抑制作用，MIC約為其使用劑量的2.5倍稀釋。
以上結果表明，婦陰康洗劑對細菌(需氧菌和厭氧菌)、真菌均有不同程度的抑制作用，對需氧菌的效果較好。
婦陰康洗劑對細菌、真菌的MIC值
試驗菌(株數) | MIC範圍/(μg·mL-1) | ||||
婦陰康洗劑(稀釋度)* | 醋酸氯己定 | 甲硝唑 | 咪康唑 | ||
細菌(需氧菌) | 金黃色葡萄球菌(6) | 1/20～1/5 | 4 | — | — |
表皮葡萄球菌(6) | 1/20～1/10 | 16 | — | — | |
大腸埃希菌(6) | 1/20～1/10 | 2～4 | — | — | |
銅綠假單胞菌(6) | 1/10～1/5 | 16 | — | — | |
細菌(厭氧菌) | 加德納菌(6) | >2/5 | — | >200 | — |
克氏動彎桿菌(2) | 2/5 | — | >200 | — | |
二路普雷沃菌(2) | 2/5 | — | >200 | — | |
乳桿菌(6) | 1/5 | — | >200 | — | |
真菌 | 白色念珠菌(6) | 2/5 | — | — | 25 |
註：*MIC稀釋度指婦陰康洗劑臨床使用劑量的稀釋度。
婦陰康洗劑對細菌和真菌的殺菌曲線
2/5稀釋度的婦陰康洗劑對細菌和真菌有殺傷作用。
其能在24 h內，使金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、加德納菌、乳桿菌下降約1 lg(CFU/mL),使表皮葡萄球菌下降約2 lg(CFU/mL),使白色念珠菌下降約3 lg(CFU/mL)。
以上結果表明，婦陰康洗劑能在較長時間內維持穩定、溫和的殺菌作用，但殺菌速度較慢。
婦陰康洗劑對加德納菌感染引起大鼠陰道炎的抑菌抗炎作用
與模型組比較，婦陰康洗劑各劑量組大鼠陰道內加德納菌載菌量降低約0.7 lg(CFU/mL)(P<0.05),而不抑制乳桿菌數量(P>0.05)。
此外，圖3C顯示，婦陰康洗劑組大鼠陰道病變程度較模型組減輕。
以上結果表明，婦陰康洗劑可抑制加德納菌生長，但對陰道菌群優勢菌乳桿菌沒有明顯抑制作用，同時可減少充血、水腫、出血、炎性浸潤等癥狀，發揮抗炎作用。
婦陰康洗劑對白色念珠菌感染引起大鼠陰道炎的抑菌抗炎作用
與模型組比較，婦陰康洗劑各劑量組大鼠陰道內白色念珠菌的載菌量降低約2 lg(CFU/mL)(P<0.01),而不抑制乳桿菌數量(P>0.05)。
婦陰康洗劑組大鼠組織充血、中性粒細胞和單核巨噬細胞浸潤等癥狀減輕。
以上結果表明，婦陰康洗劑可抑制白色念珠菌生長，但不抑制陰道菌群優勢菌乳桿菌，並發揮抗炎作用。
婦陰康洗劑對加德納菌誘導RAW 264.7細胞炎症因子分泌的抑制作用
與模型組比較，婦陰康洗劑組加德納菌感染誘導的細胞IL-1β和TNF-α分泌減少(P<0.05,P<0.01)。
婦陰康洗劑可改善細胞形態，減輕細胞損傷，表現出良好的保護作用。
以上結果表明，婦陰康洗劑能減輕加德納菌感染所致的細胞炎症反應，並對RAW 264.7細胞形態有明顯改善作用。
婦陰康洗劑對白色念珠菌誘導RAW 264.7細胞炎症因子分泌的抑制作用
與模型組比較，婦陰康洗劑組白色念珠菌感染誘導的細胞促炎因子IL-1β和TNF-α分泌減少(P<0.01)。
婦陰康洗劑具有良好的形態保護作用。
以上結果表明，婦陰康洗劑能減輕由白色念珠菌感染所致的細胞炎症反應，並對RAW 264.7細胞形態有明顯改善作用。
陰道炎是臨床最常見的婦科疾病之一，病原體入侵導致陰道黏膜或黏膜下結締組織發生炎症，常見的臨床陰道炎症包括黴菌性陰道炎、細菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎等。
近年來，許多天然中草藥單體成分都被證實具有抑菌活性。
姜科植物如高良姜、莪術和薑黃等醇提物已被證實具有抗真菌活性，其中也包括耐葯真菌。
丁香酚可與真菌細胞膜結合，改變其結構或通透性，從而破壞酵母的細胞質膜，使得細胞內成分的釋放。
穿心蓮內酯磺酸鈉鹽具有顯著的體內抗金黃色葡萄球菌感染活性、抗炎活性及免疫調節能力。
此外，臨床上也有多種用於陰道炎治療的中藥復方外用製劑，如本研究所用的婦陰康洗劑。
婦陰康洗劑是可用於細菌性陰道病、滴蟲性陰道炎、念珠菌陰道炎等陰道炎治療的外用洗液。
本研究發現，婦陰康洗劑在體外對多種需氧菌、厭氧菌、真菌都具有良好的抑菌活性，並能在較長時間內維持穩定、溫和的殺菌作用，其對白色念珠菌的MIC為其使用劑量的2.5倍稀釋，對白色念珠菌的體外抑菌效果優於加德納菌。
在白色念珠菌、加德納菌誘導的RAW 264.7細胞感染模型中，婦陰康洗劑可抑制細胞炎症因子IL-1β、TNF-α分泌，並可減少細胞偽足伸長，減少細胞損傷。
在大鼠陰道局部感染模型中，婦陰康洗劑對大鼠陰道組織處的白色念珠菌的殺菌效果明顯優於加德納菌，並發揮抗炎作用，這與體外實驗結果相一致。
此外，婦陰康洗劑對陰道菌群優勢菌乳桿菌沒有明顯的抑制作用。
綜上所述，婦陰康洗劑具有良好的體內外抑制白色念珠菌、加德納菌的作用，表現出明顯的體外抗炎活性，並對白色念珠菌、加德納菌感染所致陰道炎表現出明顯藥效。
市售的陰道洗液品類較多，療效不一，許多洗液不僅不能殺滅致病菌，還可能會錯殺有益菌，導致陰道菌群失調，而抗生素的濫用會導致病原菌出現耐藥性，給後續治療帶來極大影響。
加德納菌和白色念珠菌是臨床上常見的婦科疾病患陰道炎的主要致病菌，因此選擇合適的殺菌藥物顯得尤為重要。
本研究結果顯示，婦陰康洗劑具有較好的體外抑制細菌生長作用，作為多組分中藥洗劑不易產生耐藥性，對陰道菌群優勢菌乳桿菌無抑制作用，並對白色念珠菌和加德納菌局部感染性大鼠陰道炎模型均具有較好藥效和抗炎作用，可為臨床婦陰康洗劑的用藥指導提供依據。
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