「Cell Research」北大湯富酬團隊：一種長讀單細胞ATAC測序方法，同步檢測染色質可及性和遺傳變異

2022年10月12日18:39:27 科學 1020

本文為轉化醫學網原創，轉載請註明出處

作者：Lily

導讀：可訪問的染色質區域（the accessible chromatin regions）在人類基因組調控元件（regulatory elements）中富集。通過對可訪問的染色質區域的研究，科學家們已鑒定出許多與人類疾病相關的遺傳變異。目前，對單個細胞內開放染色質區域進行檢測的一種成熟方法是：通過下一代測序（NGS）平台，使用測序技術對轉座酶可及性染色質（transposase-accessible chromatin）進行單細胞測定（即scATAC-seq）。

然而，這種方法依然面臨著挑戰：對於來自scATAC-seq的數據，若要進行單倍型定相（haplotype phasing）或探測其中的大規模結構變異（large-scale structural variations）——例如插入（insertions）、缺失（deletions）、重複（duplications）、反轉（inversions）、異位（translocations）——依然存在難度。這些挑戰可以通過基於第三代測序（TGS）平台的單分子長度測序（single-molecule long-read sequencing）進行解決。

為了將長讀測序的優勢整合到scATAC-seq中，北京大學生命科學學院生物醫學前沿創新中心湯富酬教授團隊開發了一種基於納米孔測序平台的轉座酶可及性染色質單細胞測定方法（scNanoATAC-seq）——該方法是一種基於微板的scATAC-seq方法，可以與TGS測序平台相兼容。相關研究成果於10月11日發表於Cell Research雜誌。

https://www.nature.com/articles/s41422-022-00730-x

評估scNanoATAC-seq

為了評估scNanoATAC-seq在捕獲單個細胞中染色質可及性方面的性能，研究團隊在五種人類細胞系（GM12878，eHAP1，HEK293T，HFF-1和K562）以及人外周血單核細胞（PBMC）中測試了scNanoATAC-seq方法。此研究中，scNanoATAC-seq 文庫的讀取長度中位數範圍為4000 bp至4900 bp。研究者使用轉錄起始位點（TSS）富集、片段數和讀端的分數（FRIP）評估了scNanoATAC-seq方法產生的數據的質量。

GM12878細胞的scNanoATAC-seq讀取端在TSS周圍顯示出強烈的富集模式和圍繞CCCCTC結合因子（CTCF）結合位點的足跡，這與基於NGS的scATAC-seq數據中的相似。研究團隊利用編碼候選順式調節元件（cCRE）來分析從基於NGS的scATAC-seq數據和基於TGS的SCNANOATAC-seq數據調用的GM12878細胞的峰分布。在scNanoATAC-seq峰中，發現CTCF純元素和遠端增強子樣特徵（dELS）的比例增加，而啟動子樣特徵（PLS）和近端增強子樣特徵（pELS）的比例相對低於基於NGS的scATAC-seq，類似於基因區域注釋的富集譜。在K562細胞和HEK293T細胞的峰中發現了一致的注釋結果。當研究者使用cCRE集作為監管元素的基準來評估峰值調用的精度和召回率時，基於NGS的scATAC-seq和基於TGS的scNanoATAC-seq之間的性能相當。

研究團隊進行了兩批物種混合實驗，使用四種等量混合的細胞系，包括兩種人細胞系（K562和GM12878）和兩種小鼠細胞系（mESC和MEF）。在兩個技術重複中，2.2%（223個中的5個）和1.6%（248個中的4個）單細胞被鑒定為雙細胞，這對於單細胞染色質可及性測序是可以接受的。

接下來，研究者將五個人類細胞系的scNanoATAC-seq數據投影到均勻流形近似和投影（UMAP）空間中。每個細胞系都通過無監督聚類很好地區分，沒有顯著的批次效應。

為了估計scNanoATAC-seq的單細胞的最佳通量，研究者通過對讀數進行採樣來模擬單細胞數據，而無需從每個細胞系的偽體積替換到每個細胞的特定數量的讀數。每個細胞一萬次讀數（每個測序運行2000個細胞）是scNanoATAC-seq方法的最大通量。

研究者在細胞類型特異性轉錄因子的結合位點上發現了強烈的足跡，這與10×scATAC-seq數據中的足跡一致。為了評估scNanoATAC-seq方法是否適用於體內樣品，研究者對來自單個供體的分選和未分選的PBMC進行了scNanoATAC-seq。CD4 T細胞，CD8 T細胞，B細胞和單核細胞在分選和未分類的PBMC中均被清楚地鑒定出來，沒有顯著的批次效應。為了將 scNanoATAC-seq 數據的峰值呼叫質量與 10× scATAC-seq 數據的峰值呼叫質量進行比較，還對 PBMC 進行了基於cCREs的基準測試。測試結果表明，scNanoATAC-seq在鑒定不同的細胞群和揭示每個細胞群染色質可及性的關鍵調節特徵方面表現良好。

一種基於納米孔測序平台的轉座酶可及性染色質單細胞測定方法（scNanoATAC-seq）——該方法是一種基於微板的scATAC-seq方法，可以與TGS測序平台相兼容。

研究意義

scNanoATAC-seq是一種基於TGS平台的長讀單細胞ATAC測序方法，可應用於各種生物學領域。它可以同時檢測單個細胞內的染色質可及性和遺傳變異（包括SV，SNPs和CNV）。此研究揭示了等位基因特異性峰值（allele-specific peaks，ASPs）——即使是在某個峰值內不存在雜合的單核苷酸多態性（heterozygous SNPs）。這對於基於NGS平台的短讀scATAC-seq而言，是無法實現的。

研究提供了來自scNanoATAC-seq的相鄰峰之間共通性直接證據，其中同一單個細胞中兩個位點的染色質可及性以及實際上在同一等位基因上的染色質可及性是通過長讀數同時檢測到的。

在目前的測序深度下，scNanoATAC-seq文庫的成本不到每細胞2.5美元。由於在相同測序深度下，ONT（(Oxford Nanopore Technologies）測序的成本仍高於NGS平台的成本，所以需要根據不同需求來選擇測序方法——通過更多片段以富集更強烈的表觀遺傳信號，或是通過長讀方式來探測長讀取特異性特徵（例如結構變異SVs 等）。

參考資料：

https://www.nature.com/articles/s41422-022-00730-x

註：本文旨在介紹醫學研究進展，不能作為治療方案參考。如需獲得健康指導，請至正規醫院就診。