「本次成果是一個關於細胞生物學的基礎研究，本來沒有仔細思考相關的應用。比較意外的是在論文發表幾天後，好幾個學界實驗室和業界投資機構聯繫我。」復旦大學研究員魯伯塤表示。
圖 | 魯伯塤（來源：魯伯塤）
近日，他和團隊在細胞質里發現一種變異 RNA 的相分離和相變過程，並闡述了這一過程對於細胞功能的影響機制。
相關論文在投稿過程中也獲得了較高評價，評審專家表示：「這項成果將成為研究重複基因相關疾病的一個里程碑」「將為 polyQ 重複序列疾病提供新的操縱機制」。
（來源：Nature Chemical Biology）
目前來看短期的應用可能有兩個：一是利用此次建立的光控 RNA 相分離和相變系統，進一步研究 RNA 聚集體的成分以及相關功能。二是對於 CAG 重複擴增疾病，例如亨廷頓病和共濟失調來說，RNA 靶向的治療手段或可作為 polyQ 蛋白靶向手段的補充。
而此次成果的研究背景，主要涉及以下三個方面：
其一，本次研究涉及到 RNA 分子的相分離（liquid-liquid phase separation，LLPS）和相變（phase transition，PT）。
在混合均勻的液體中，由於分子間的相互作用，高分子聚合物在溶液中產生凝聚體的過程——被稱為相分離。而凝聚體從液態相轉變為更固化的膠體或固體相的過程——被稱為相變。
近年來，人們發現很多蛋白質都會產生相分離和相變，並能參與重要的生理病理活動。
在蛋白質之中，那些氨基酸種類較少、重複較多的低複雜度無序區（low-complexity domains，LCD），被認為是驅動相分離和相變的關鍵。
除了蛋白質之外，RNA——是細胞內另一種最主要的生物大分子。但是，在已有的相分離和相變研究中，RNA 基本都是「配角」。
RNA 通過與蛋白質的相互作用，間接地影響蛋白質的相變。然而，作為一類大小超過蛋白質、複雜度比 LCD 更低、且容易形成分子間相互作用的分子， RNA 在驅動相分離和相變上具備更大的可能性。
其二，本次研究涉及到神經退行性疾病。
這類疾病以中樞神經系統的神經元繼發性、持續性萎縮死亡為特徵，其中最主要的一類遺傳性神經退行性疾病是 CAG 重複序列擴增疾病。
目前，在 CAG 重複序列擴增疾病中，包含至少 9 種人類疾病，它們都是由不同基因所包含的過長 CAG 重複序列所導致的。
在遺傳學上，這類疾病的核心問題在於：為何不同基因的 CAG 重複數超過一定的閾值（35~40 左右）就會導致疾病？
其中，領域內最主要的觀點是：超過閾值重複數的 RNA 所表達的蛋白，具有過長的谷氨酰胺重複（polyQ）。由於這些蛋白具有神經毒性，故會導致疾病的發生。
然而，近年來也有研究表明，特定的神經功能影響或特定的 CAG 重複數區間，似乎不能完全使用 polyQ 蛋白來解釋。
而本次研究提示：包含過長 CAG 重複的 RNA 相分離和相變過程，可能會對細胞功能乃至動物的行為學表型產生一定影響。這一提示的價值在於，能為理解疾病機制和干預疾病提供新的角度。
其三，本次研究涉及到蛋白質合成。
根據中心法則，DNA 在轉錄成為 RNA 之後，要通過翻譯過程變成蛋白質。而蛋白質是細胞功能最主要的執行者。
因此，蛋白質合成——是細胞內的核心事件。研究中，該團隊發現只有一個基因突變所導致的變異 RNA 的表達，就能抑制全局的蛋白質合成。
也就是說，在細胞中成千上萬的蛋白合成速度變慢了很多。在此基礎之上，他們進一步解析了關於蛋白質合成的全新調控機制。
而對於整個研究過程，魯伯塤用突發奇想、驚人發現、磨刀不誤砍柴功、「誤入歧途」、靈光一現、柳暗花明等六步來形容。
第一步是突發奇想。
美國馬里蘭大學凌繼強教授，是魯伯塤的本科同學。一次聊天中對方提到：重複序列的 RNA 在所對應的氨基酸不足的時候，由於要連續翻譯同一個氨基酸，可能會造成核糖體卡出現在氨基酸上面，從而影響翻譯。
於是，魯伯塤猜測這是否會讓整個細胞的 RNA 翻譯被抑制，從而降低細胞全局蛋白的合成速率？
搜索文獻之後，魯伯塤發現相關的研究寥寥無幾，而且沒有令人信服的結論，這也讓他對於檢測上述假說萌生興趣。
第二步是驚人發現。
最初，他抱着試一試的想法，安排兩位學生用亨廷頓病的紋狀體細胞來檢測上述假說。
之所以這樣做，是因為該類細胞可以表達過長的 CAG 重複序列 RNA，並且含有過長的 polyQ 蛋白。
魯伯塤說：「原本我估計可能有 20%-30% 的降低，也打算通過多次重複來明確。但是讓我吃驚的是，儘管兩位學生各自開展了獨立研究，然而他們一致地發現：相比正常細胞，亨廷頓病細胞的蛋白質合成速度出現極為明顯的下降，至少下降 80%-90%。」
對於這一結果魯伯塤不太敢相信，於是他親自設計實驗，分別利用幾種獨立技術，來對上述現象進行明確。
並通過敲低、過表達、敲除等手段，證明上述細胞的整體翻譯抑制現象是真實存在的，而且的確是由於包含過長 CAG 重複序列的突變基因所導致的。
第三步是磨刀不誤砍柴功。
在發現翻譯抑制的現象以後，魯伯塤很想摸清楚背後的機制。但是，蛋白質翻譯對他來說，是一個完全陌生的領域。
其表示：「我和學生通過閱讀文獻和請教領域內的專家，發現要想進一步研究背後機制，就必須新建一些實驗技術體系。」
後來，在建立新的技術體系時，多位業內專家均給予熱情幫助。
「學生也特別勇敢，願意遠赴北京和美國馬里蘭等地學習新技術，學完之後帶回了我們實驗室。」魯伯塤說。
第四步是「誤入歧途」。
當時，課題組對全局翻譯抑制的機制提出多個猜測。而在開展大量實驗之後，他們基本排除了上述所有猜測的可能性，而且基本排除 polyQ 蛋白作為主要原因的可能性。
第五步是靈光一現。
在排除 polyQ 蛋白這一原因之後，課題組認為導致細胞全局 mRNA 翻譯速率下降的分子，很有可能是 CAG 重複序列 RNA。但是，變異 RNA 和野生型 RNA 的序列完全相同，只不過變異 RNA 的 CAG 重複數更多，僅憑此為何就能造成細胞全局 mRNA 翻譯抑制呢？
魯伯塤表示：「這讓我想起幾年前美國兩院院士羅納德·韋爾（Ronald Vale）課題組的 Nature 論文。那篇論文報道稱：在體外生理性鹽溶液里，含有過長 CAG 重複數的 RNA，會發生相分離和相變；而短的 CAG RNA 則基本不會發生。那麼，有沒有可能是 RNA 的相分離和相變，導致了全局翻譯的抑制？」
按照上述 Nature 論文進行重複實驗之後，他發現與論文報道一致；變異 RNA 在細胞內的相分離，幾乎只發生在細胞核內，並不會發生在細胞質內。
這就造成了一個矛盾：蛋白合成過程，基本只發生在細胞質之內。那麼，細胞核內的 RNA 的相分離如何影響細胞質內發生的翻譯過程？
針對此，魯伯塤也提出過一些猜想，但卻覺得可能性都比較低。
他說：「有一天我退回一步想了想：為何在體外生理鹽溶液中，變異 RNA 自己就能相變？到了細胞質裏面反而就不行了？突然我靈光一現，RNA 是否在細胞質也形成了聚集體併產生相變？只是由於細胞質有很多溶酶體，因此可以不斷清除這些聚集體，導致它很難被觀測到？」
隨後，他又提出新的假說：如果阻斷溶酶體的功能，或者不讓聚集體被溶酶體識別，或許就能在細胞質中觀察到變異 RNA 相分離產生的聚集體？而正是這些細胞質的 RNA 聚集體抑制了全局翻譯。
第六步是柳暗花明。
在學生通過實驗有力證明上述假說之後，魯伯塤再接再厲又提出了新的一系列假說，並對實驗結果進行預測，結果一一得到驗證。
此外，他在清華大學李丕龍教授的啟發下還提出一個使用藍光來控制 RNA 相分離和相變的方法。在這個方法的幫助之下，他和團隊使用藍光來控制全局蛋白合成速率的變化，有力證明了此次提出的核心結論。
最終，課題組基本解析了 RNA 相變影響全局翻譯的核心機制，並在小鼠動物模型中觀察到對於小鼠電生理和行為學的影響。
日前，相關論文以《細胞質擴增的 CAG RNA 重複序列的凝膠化抑制了蛋白質的全局合成》（Gelation of cytoplasmic expanded CAG RNA repeats suppresses global protein synthesis）為題發在 Nature Chemical Biology（IF 14.8）。
復旦大學博士生潘宇寅、博士後盧俊梅、本科生馮欣然和魯盛誼是共同一作（均為論文投稿時身份），復旦大學研究員魯伯塤和英國普利茅斯大學教授羅壽青擔任共同通訊作者[1]。
圖 | 相關論文（來源：Nature Chemical Biology）
另據悉，此前魯伯塤的小分子化合物成果曾入選 2019 年度十大傑出論文，這也是他在神經退行領域的代表工作之一。
2020 年，魯伯塤又獲得科學探索獎，主要基於他在神經退行領域的一系列研究工作，特別是基於所提出的「自噬小體綁定化合物」的原創型降解技術。
藉助這一技術，他和合作者成功實現了致病蛋白和脂滴的靶向降解，為干預各類「不治之症」帶來了新思路。
參考資料：
1.Pan, Y., Lu, J., Feng, X. et al. Gelation of cytoplasmic expanded CAG RNA repeats suppresses global protein synthesis. Nat Chem Biol (2023). https://doi.org/10.1038/s41589-023-01384-5
