EagleC是一個結合了深度學習和集成學習策略的框架，能以高分辨率預測全範圍的結構變異。
背景介紹
結構變異(SVs)，包括缺失、倒置、重複和易位等，可通過多種機制直接導致腫瘤和其他疾病的發生。最近，研究表明，SVs可以將遠端增強子帶到原癌基因附近，並通過一種被稱為增強子劫持的機制，導致致癌基因表達上調。複發性SVs的發現，大大提高了人們對腫瘤發生的認識，有利於有效的靶向治療。
儘管它們很重要，但全基因組檢測SVs仍然是一個具有挑戰性的問題。傳統上，核型分析一直是臨床檢測各種遺傳病的主要方法，本質上是一種低吞吐量和低分辨率的方法。另外，基因芯片已被用於識別遺傳物質的得失，但它在檢測拷貝數中性事件如倒置和平衡易位方面有局限性。近年來，短讀全基因組測序(short-read全基因組測序，WGS)，因其高分辨率、高通量和簡單性而被廣泛用於識別各種基因組變異。但由於短讀的可映射性問題，使用WGS很難檢測到重複性區域的SVs。
最近，研究者及其他團隊發現了Hi-C，一種最初被用於研究三維基因組結構的技術也可以用於系統的SV檢測，基因組覆蓋率低至1×。到目前為止，人們已經提出了三種利用Hi-C數據預測SVs的方法，但均有其局限性因此不是最優的。HiCtrans和HiNT-TL無法預測染色體內SVs，而Hi-C breakfinder只能檢測到大小為>1 Mb的大的染色體內SVs。
主要內容
美國西北大學的岳峰等人開發出的EagleC可以獨特地捕獲一組全基因組測序或納米孔缺失的融合基因，在精確度和召回率方面都優於現有方法。此外，EagleC還能在其他染色質相互作用平台上有效捕獲SVs，如HiChIP、染色質相互作用分析與成對末端標籤測序(ChIA-PET)，並捕獲Hi-C。研究者將EagleC應用於100多個癌症細胞系和原發腫瘤，並識別出一組有價值的高質量SVs。最後，研究者證明EagleC可以應用於單細胞Hi-C，並用於研究原發性腫瘤中SV的異質性。
EagleC框架概述
圖1A描述了EagleC框架的總體設計。正訓練樣本被定義為圍繞一組高置信度SVs的Hi-C接觸矩陣，這些SVs通過WGS和光學圖譜在8個癌細胞系(A549、Caki2、K562、LNCaP、NCI-H460、PANC-1、SK-N-MC和T47D)中被檢測到。此外，為了使模型能夠區分真實的SV信號和正常3D基因組特徵誘導的假陽性信號，研究者從正常細胞系GM12878的Hi-C圖譜中，採樣了數量相近的染色體內和染色體間亞基，並分別標記為內負性和間負性。此外，還包括來自癌症Hi-C數據的矩陣，它們位於SV塊中但不與斷點重疊，是額外的負數據集。
圖1. EagleC根據染色質相互作用數據預測了全範圍的高分辨率SVs。圖片來自Sci. Adv.
研究者使用訓練樣本的下採樣版本，訓練了一系列針對不同測序深度優化的EagleC模型。為了研究EagleC的性能，研究者預測了訓練過程中未使用的其他癌症Hi-C數據集中的SVs(文中默認所有SVs分辨率均為5kb)。EagleC成功預測了不同類型的SVs，包括斷點距離小於1 Mb甚至100 kb的短程SVs(圖1,B-D)、大的染色體內SVs(圖1E)、互易的染色體間易位(圖1F)和非互易的染色體間易位(圖1G)。
EagleC在Hi-C圖上檢測SVs中優於現有的方法
研究者首先直觀地檢查了預測結果，發現幾乎所有具有異常高相互作用頻率的塊都被預測為SVs，這表明框架具有很高的靈敏度(圖2A)。在許多情況下，雖然EagleC和Hi-C breakfinder預測了相同的SV塊，但預測斷點的確切坐標不同，EagleC預測斷點更有可能被WGS驗證(圖2A，區域「A」，「C」，「D」和「E」)。此外，EagleC在5kb分辨率下預測的斷點比Hi-C breakfinder預測的更精確，Hi-C breakfinder通常是100kb分辨率。
圖2. EagleC在精確度和召回率上的優越表現。圖片來自Sci. Adv.
然後，研究者對兩種目前唯一可以識別染色體內SVs的方法---EagleC和Hi-C breakfinder進行了更深入的比較。值得注意的是，EagleC在BT-474、HCC1954和MCF7中檢測到的SVs(包括染色體間易位和染色體內SVs)分別是Hi-C breakfinder的2.4倍(244/100)、2.6倍(410/157)和4.8倍(244/51)(圖2B)。同時，EagleC在這些細胞系中取得了明顯高於Hi-C breakfinder的精度率。
在BT-474中，24.2%的EagleC預測的SVs與59.0%的Hi-C breakfinder預測相匹配。在EagleC特有的185個SVs中，83.2%可以通過WGS或納米孔進行驗證，相比之下，Hi-C breakfinder特有SVs的驗證率為2.4% (圖2C)。
接下來，研究者將分析擴展到另外26個具有Hi-C和WGS數據的癌症細胞系或患者樣本。再次觀察到，與Hi-C breakfinder相比，EagleC在所有26個癌症樣本中取得了顯著更高的召回率和準確率(圖2D-F)。由於算法本身的局限性，Hi-C breakfinder只能檢測到大於1 Mb的大的染色體內SVs。但是，如圖2G所示，EagleC預測的39.5%的染色體內SVs是短距離SVs，最小為35 kb。令人驚訝的是，儘管人們認為很難將這一範圍的SVs與其他Hi-C接觸模式區分開來，但它們的預測精度甚至高於遠程SVs和易位(圖2H)。
EagleC檢測癌症中新的融合基因
如圖3A所示，EagleC在MCF7中檢測到了ATXN7和BCAS3基因內部的斷點，而arriba軟件也預測了這兩個基因的融合(圖3A，右)。研究者在圖3中展示了另外兩個這樣的例子，表明由於EagleC的高分辨率特性，它可以獨特地預測WGS和納米孔缺失的融合基因。另外，與未進行融合的非惡性細胞系相比，參與這些融合事件的基因在癌細胞中顯著過表達(圖3D)。
圖3. EagleC唯一檢測到的融合基因在癌細胞中過表達。圖片來自Sci. Adv.
EagleC可以使用其他基於3C的技術準確地預測SVs
研究者直接將Hi-C數據訓練的EagleC模型，應用於CTCF ChIA-PET和Pol2 ChIA-PET。總的來說，EagleC在Hi-C、CTCF ChIA-PET和Pol2 ChIA-PET中預測了類似數量的SVs，並且三個數據集之間有很大的重疊(圖4A-B)。例如，EagleC在CTCF ChIA-PET中預測了226個SVs，其中66.4%在Hi-C中也預測到了。同樣，Pol2 ChIA-PET中預測的62.8%(196個中的123個)SVs與Hi-C預測的50.4%(244個中的123個)相匹配。就精度而言，相比於Hi-C(73.8%)，EagleC在兩個ChIA-PET數據集中取得了相當的精度(CTCF，65.5%;和Pol2, 68.2%)(圖4C)。此外，研究者觀察到，在所有10個與WGS數據匹配的HiChIP/ChIA-PET數據集中，EagleC預測的SVs的召回率和準確率都顯著高於Hi-C breakfinder(圖4D-F)。
圖4. EagleC可以準確預測HiChIP和ChIA-PET接觸圖上的SVs。圖片來自Sci. Adv.
105例腫瘤標本中SVs的檢測
如果在同一個樣本中有多個數據集可用，將它們的結果結合起來可以形成更全面的SV注釋集。研究者預測了所有樣本中的5620個SVs，每個樣本中的數量從2到410不等(圖5A)。所有樣本數據中，30.9%的預測SVs是短程SVs (<1 Mb)，35.7%是長程SVs，33.4%是染色體間易位。
在超級酶尺度上，哺乳動物的基因組被組織成TADs。CTCF結合位點富集的TAD邊界為適當的基因調控提供了一個絕緣的環境。與隨機打亂的SV的預期分佈相比，研究者發現SV的斷點明顯靠近TAD邊界，這與之前的研究結果一致，即DNA拓撲異構酶II beta (TOP2B)介導的DNA雙鏈斷裂在染色質環的錨點富集(圖5C)。總體而言，約10%的SVs發生在TAD邊界之間，37.5%發生在TAD邊界與TAD內區域之間，52.5%發生在TAD內區域之間(圖5D)。此外，研究者發現癌症相關基因的轉錄起始位點(TSSs)在斷點相關的TAD邊界特異富集(圖5E)。這表明基因組重排列破壞TAD邊界，可能是致癌基因失調和腫瘤發生的重要機制。
圖5. 105株癌細胞或患者樣本中SVs的泛癌分析。圖片來自Sci. Adv.
為了進一步探索研究者的SV注釋的價值，研究者鑒定了不同樣本中反覆受到短程SV影響的基因。結果發現大部分缺失的基因是腫瘤抑制基因(圖5F)，如CDKN2A/2B、WWOX、CHFR和MSH2基因。另一方面，在重複區域內的很多基因都是癌基因(圖5G)，如MYC。CD44基因是癌症幹細胞的常見生物標誌物，編碼一種參與腫瘤起始和進展的細胞表面糖蛋白。
EagleC預測單細胞中已知的染色體間易位
為了使EagleC在每個細胞接觸信息有限的情況下適用於scHi-C，研究者將相同的8個癌細胞株和GM12878細胞的接觸圖譜降採樣到可比較的測序深度，並在500 kb分辨率下重新訓練模型。然後，研究者在HAP1和K562中發表的scHi-C數據集上測試了EagleC，這兩種細胞都是慢性髓系白血病細胞系。HAP1細胞中9號染色體和22號染色體為互易位，而K562細胞中9號染色體和22號染色體為非互易位。HAP1數據集包含256個單細胞，每個細胞中位數為18793個接觸，而K562數據集包含337個細胞，每個細胞中位數僅為3974個接觸(圖6A)。值得注意的是，即使使用這些極其稀疏的接觸矩陣，EagleC也能夠預測單細胞中已知的chr9-chr22易位(圖6B-C)。
圖6. EagleC可以準確預測HiChIP和ChIA-PET接觸圖上的SVs。圖片來自Sci. Adv.
為了系統地研究準確預測單個細胞中SVs的接觸數下限，研究者根據測序深度對所有256個HAP1細胞進行了排序，並通過匯聚到99個最深的單個細胞產生了一系列的接觸矩陣(接觸對從148635萬到405萬)(圖6D)。正如預期的那樣，預測的SVs數量隨着細胞數量的增加而減少(圖6E)。
結論總結
本文利用CNNs在圖像識別和集成學習避免過擬合問題的優勢開發的EagleC不僅能預測出唯一的近距離SVs，且與現有方法相比，大大提高了整體預測能力。本文證明了利用Hi-C檢測融合基因的可行性，雖然目前的框架無法達到鹼基對分辨率，但與RNA-seq相比，Hi-C在檢測內含子內融合點方面具有獨特的能力。此外，EagleC可以作為一個通用模型來預測SVs，使用其他基於3C的接觸圖，包括ChIA-PET，HiChIP/PLAC-Seq，capture Hi-C，甚至是scHi-C。
參考文獻
Wang X, Luan Y, Yue F. EagleC: A deep-learning framework for detecting a full range of structural variations from bulk and single-cell contact maps[J]. Science Advances, 2022, 8(24): eabn9215.
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