臨床容易受到病菌侵蝕，但抗菌藥物廣泛使用，讓有些疾病難以治癒

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銅綠假單胞菌(PA)是臨床最重要的條件致病菌之一，可以引起肺部、皮膚軟組織、血液和泌尿系統等多個部位的感染。

全國和本院2019年的細菌耐葯監測報告都顯示，PA的臨床分離率在革蘭陰性致病菌中排第3位，約佔12%。

隨着抗菌藥物的廣泛使用，強大的環境選擇壓力導致了PA的耐葯機制越來越複雜和多樣，包括產酶、藥物作用靶位改變、主動外排機制、膜通道蛋白缺失和生物膜形成等。

其中生物膜一旦形成，PA就很難被徹底清除，這是導致臨床出現難治性、慢性感染病例的重要原因。

治療生物膜相關感染時，醫生往往會聯合使用敏感且膜滲透性能好的抗菌藥物，除了及時清除播散性細菌，還可以降低感染部位的生物膜負載。

但是由於細菌耐藥性的增加，尤其是多重耐葯菌株的逐漸增多，抗菌藥物在體內的濃度常常達不到最低抑菌濃度(MIC)，即處於亞抑菌濃度狀態。

此狀態下，對於臨床常用抗菌藥物聯合對PA生物膜的作用效果還缺少系統性評價。

本研究旨在以臨床黏液型多重耐葯PA菌株為對象，比較在1/2MIC亞抑菌濃度時，6種臨床常用抗菌藥物聯合使用對其生物膜的體外抑制效果。

收集2020年10月至2021年3月本院臨床微生物室分離的黏液型多重耐葯PA菌株6株。

細菌鑒定和葯敏試驗採用法國生物梅里埃VITEK2Compact全自動細菌鑒定及葯敏分析系統，多重耐葯的判定標準為對3類或3類以上臨床常用抗菌藥物不敏感。

菌株使用含15%甘油的無菌肉湯-80℃保存。

復蘇PA菌株，統一採用CLSI推薦的微量肉湯稀釋法檢測哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢他啶(CAZ)、氨曲南(ATM)、亞胺培南(IPM)、左氧氟沙星(LVX)和慶大黴素(GEN)6種抗菌藥物的MIC，質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853。

TZP購自海南通用三洋葯業有限公司(批號：210801-2)，CAZ購自海南海靈化學製藥有限公司(批號：2110211)，ATM購自山東羅欣葯業有限公司(批號：321063008)，IPM購自杭州默沙東製藥有限公司(批號：u025798)，LVX購自華夏生生葯業有限公司(批號：210815307)，GEN購自瑞陽製藥有限公司(批號：21052611)。

將6株PA送浙江天科高新技術發展有限公司做全基因組測序，提取管家基因acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE的序列放在PAMLST數據(https://pubmlst.org/organisms/pseudomonas-aeruginosa)中比對得到序列型(ST)。

使用肉湯活化黏液型PA，並調整濃度至0.5麥氏比濁度。

吸取30μL菌液加入到含200μL肉湯的聚苯乙烯96孔板中，常溫條件下水平振蕩儀上低頻振蕩，培養48h形成生物膜。

使用高壓去離子水輕柔沖洗96孔板3次，去除浮游細菌後，倒扣，室溫晾乾。

在已構建的PA生物膜中，加入200μL含有抗菌藥物的肉湯，抗菌藥物的種類為TZP、CAZ、ATM、IPM、LVX和GEN中任意1種或2種，抗菌藥物終濃度為菌株MIC的1/2。

同時設立陰性對照孔位，加入等量無藥液肉湯。

37℃孵育48h後沖洗3次去除浮游細菌並晾乾，採用結晶紫染色洗脫法定量檢測殘留生物膜:(1)加入200μL1%的結晶紫染色液，室溫染色10min。

(2)沖滌後加入200μL乙醇：丙酮洗脫液(V∶V為70∶30)室溫作用10min。

(3)使用酶標儀測定洗脫後孔位595nm的吸光度(A)並計算生物膜抑制指數[9]。

生物膜抑制指數=[(對照孔位A值-測試孔位A值)/對照孔位A值]×100%。

生物膜抑制效果的評價實驗均平行做2次，生物膜抑制指數取均值。

對正態分佈的計量資料兩組間均值比較採用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

6種抗菌藥物TZP、CAZ、ATM、IPM、LVX和GEN對黏液型多重耐葯PA的MIC。

測序後提取6株黏液型多重耐葯PA的管家基因acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE的序列，放在PAMLST數據進行MLST數據比對，結果顯示均為ST235型。

種抗菌藥物對PA的MIC(μg/mL)

菌株編號	TZP	CAZ	ATM	IPM	LVX	GEN
PA29016	64	16	32	64	8	16
PA01005	64	16	16	64	16	32
PA09012	64	16	16	32	2	0.5
PA03019	2	4	4	8	0.5	0.5
PA06053	16	8	16	8	1	2
PA26017	64	16	64	128	16	16

在1/2MIC時，TZP、CAZ、ATM、IPM、LVX、GEN單獨或聯合對6株多重耐葯PA的生物膜抑制指數。

6種抗菌藥物中任意2種聯用或單獨使用分別作用於6株PA的生物膜，獲得的生物膜抑制指數均符合正態分佈(P>0.1)。

2種藥物聯用的15種組合當中，LVX+IPM和LVX+ATM的生物膜抑制指數大於70.0%，GEN+IPM、TZP+ATM、ATM+IPM和GEN+TZP的生物膜抑制指數大於60.0%，其餘9種組合的生物膜抑制指數大於50.0%。

6種藥物單獨作用於生物膜，抑制指數均小於50.0%，均值從大到小依次為LVX、IPM、ATM、GEN、TZP和CAZ，其中LVX的抑制指數均值為42.3%。

對21組數據進行獨立樣本t檢驗，發現任意2種藥物聯合作用的15組數據中，LVX+IPM和LVX+ATM之間及LVX+ATM、GEN+IPM與其他藥物聯用組合相比，生物膜抑制指數差異均有統計學意義(P<0.05)。

6種藥物單獨作用於生物膜的抑制指數間差異無統計學意義(P>0.05)，但小於任意2種抗菌藥物聯用組合的生物膜抑制指數(P<0.05)。

常用抗菌藥物單獨或聯合對6株PA的生物膜抑制指數(%)

抗菌藥物	PA29016	PA01005	PA09012	PA03019	PA06053	PA26017	[MathProcessingError]	s
LVX+IPM	82.0	81.5	77.9	72.8	78.9	79.4	78.8①	3.3
LVX+ATM	74.5	74.6	75.8	70.1	73.1	74.9	73.8②	2.0
GEN+IPM	66.3	67.4	65.8	67.4	58.2	66.5	65.3③	3.5
TZP+ATM	59.3	61.3	68.0	49.2	64.3	74.4	62.8③	8.5
ATM+IPM	64.7	61.7	67.2	55.5	54.6	68.8	62.1③	6.0
GEN+TZP	56.6	58.1	65.8	68.8	53.0	63.6	61.0③	6.0
GEN+CAZ	57.7	61.1	54.5	52.5	63.2	52.0	56.8③	4.6
GEN+ATM	47.7	55.0	61.2	57.1	66.0	51.4	56.4③	6.6
LVX+GEN	62.4	55.3	52.7	58.1	55.1	51.2	55.8③	4.0
LVX+CAZ	63.9	51.4	51.4	64.3	57.6	45.7	55.7③	7.5
TZP+CAZ	57.6	44.8	52.5	58.1	51.9	67.9	55.5③	7.8
CAZ+IPM	60.6	47.9	68.9	55.9	49.6	48.7	55.3③	8.3
TZP+IPM	46.9	54.5	61.7	54.2	52.4	61.0	55.1③	5.6
LVX+TZP	53.5	54.1	52.0	54.5	53.4	44.8	52.1③	3.7
CAZ+ATM	47.3	52.6	53.9	54.3	50.2	46.8	50.9③	3.3
LVX	39.0	45.2	39.1	36.7	50.3	43.7	42.3	5.0
IPM	37.4	35.0	33.0	41.1	31.2	41.2	36.5	4.2
ATM	30.4	36.3	36.2	32.6	35.6	40.0	35.2	3.3
GEN	29.2	33.4	38.1	31.0	35.1	32.0	33.1	3.2
TZP	37.7	31.8	29.6	37.0	34.6	26.7	32.9	4.3
CAZ	29.0	30.8	31.1	32.1	26.9	36.6	31.1	3.3

黏液型PA由於細胞外存在大量藻酸鹽成分，比非黏液型菌株更容易形成可見的生物膜結構，但生物膜卻是致病菌在體內定植的普遍模式。

當生物膜相關菌株同時為多重耐葯菌時，臨床醫生將很難選擇合適的抗菌藥物使用方案。

TZP、CAZ、ATM、IPM、LVX和GEN分別是青霉素類+酶抑製劑、頭孢菌素類、單環β-內酰胺類、碳青黴烯類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類的代表性抗菌藥物，本研究通過比較在亞抑菌濃度下，這些藥物對本院6株ST235型多重耐葯PA菌株的生物膜體外聯合抑制效果，發現LVX+IPM聯用的抑制效果最好，其次為LVX+ATM。

說明在相同的耐藥水平下，氟喹諾酮類與碳青黴烯類或單環β-內酰胺類抗菌藥物聯用對於PA生物膜具有更好的抑制效果。

由於不攜帶正電荷，具有良好的生物膜穿透性，氟喹諾酮類被認為是生物膜內作用效果最好的一類抗菌藥物。

有文獻報道，LVX+IPM對PA慢性肺部感染有很好的治療效果。

由於亞抑菌濃度下長時間作用，很多抗菌藥物包括氟喹諾酮類和IPM都可以誘導PA生物膜的形成及耐藥性的加強，因此臨床選擇抗菌藥物時，首先仍應根據葯敏試驗結果選擇敏感的藥物進行抗生物膜治療。

既往的體外聯合用藥表明，β-內酰胺類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥物聯合治療PA感染時，通常表現為協同、相加或無關。

本研究當中，6種抗菌藥物任意2種組合後，對生物膜的抑制效果均好於抗菌藥物單獨使用，因此臨床上在治療生物膜相關感染時應盡量選擇聯合用藥。

本研究使用的6株黏液型多重耐葯PA均分離自本院臨床患者，經MLST數據對比，顯示都歸屬ST235型，具有一定的同源性，這可能是導致本研究中的各組生物膜抑制指數均呈正態分佈的主要原因。

由於不同地區PA菌株的耐葯基因與表型不同，抗菌藥物的體外抑制效果與體內也可能存在差異，因此抗菌藥物聯合應用對PA生物膜抑制效果的比對結論後續仍有必要進一步驗證。