Cell | 告別“猜謎式”診斷！臨床意義未明變異（VUS）研究新範式，系統性破解遺傳病變異解讀難題

2025年06月28日04:02:04 科學 1744

引言

在我們的生命密碼，基因(gene)，的浩瀚篇章中，隱藏着決定我們健康與疾病的無數秘密。隨着新一代測序技術(Next-generation sequencing, NGS)的普及，我們以前所未有的速度閱讀着這本“天書”。然而，閱讀並不總是意味着理解。有時，我們發現的只是一個“未知意義的變異”(variant of uncertain significance, VUS)，它就像天書中的一個神秘字符，讓醫生和患者都陷入了深深的困惑：這個“錯字”是無傷大雅的筆誤，還是導致嚴重疾病的元兇？

這種困惑在“先天性免疫缺陷”(inborn errors of immunity, IEI)領域尤為突出。這是一種由單個基因突變導致的免疫系統疾病，種類繁多，診斷極具挑戰性。每一個VUS都可能是一個家庭漫長求索的起點，充滿了不確定性和焦慮。

6月20日，發表在《Cell》上的重磅研究“Scalable generation and functional classification of genetic variants in inborn errors of immunity to accelerate clinical diagnosis and treatment”為我們帶來了一線曙光。研究人員開發出一種強大的新技術，它如同一位技藝高超的“密碼破譯專家”，能夠系統性地、大規模地解讀這些基因“錯字”的真實含義，為精準醫療的未來描繪了一幅激動人心的藍圖。

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基因迷宮中的“未知之聲”：當測序結果帶來更多困惑

想象一下，你正在校對一部數百萬字的巨著，偶爾發現一個錯別字。你該如何判斷這個錯字是無傷大雅，還是會徹底改變整個句子的意思？這就是現代基因診斷面臨的現實挑戰。

NGS技術讓我們能夠高效地檢測出個體基因組中的變異位點，但其中絕大多數都是VUS。傳統的做法是“一事一議”，針對每個VUS進行繁瑣的實驗室驗證，或者等待在更多患者身上發現同樣的變異，並觀察他們是否有一致的臨床表現。這個過程極其緩慢，往往耗時數年，對於急需治療的患者來說，每一天都是煎熬。

研究人員將目光投向了先天性免疫缺陷(IEI)。這類疾病通常由單個基因的“功能獲得”(gain-of-function, GOF)或“功能喪失”(loss-of-function, LOF)突變引起，致病機理相對明確，是檢驗新技術能力的理想“試驗場”。

他們選擇的具體“案例”是活化PI3Kδ綜合征(APDS)，一種典型的IEI。患者的免疫系統過度活躍，常常表現為反覆的呼吸道感染、淋巴結腫大、自身免疫病，甚至淋巴瘤。這種疾病的“罪魁禍首”是編碼磷脂酰肌醇-3-激酶δ(phosphoinositide 3-kinase δ, PI3Kδ)的兩個基因——PIK3CD或PIK3R1——發生了GOF突變。

PI3Kδ是免疫細胞（尤其是T細胞）中的一個關鍵信號分子，像一個油門，控制着細胞的活化、增殖和分化。正常情況下，這個“油門”受到精確調控，踩得恰到好處。但在APDS患者體內，由於基因突變，這個“油門”被卡住了，導致信號通路持續“轟鳴”，免疫細胞變得異常興奮，從而引發一系列免疫失調。

然而，即便是在APDS這個相對明確的疾病中，醫生們也只對少數幾個已知的致病突變有把握。當在患者的PIK3CD或PIK3R1基因上發現一個新的、從未報道過的VUS時，診斷和治療的決策便再次陷入僵局。要打破這個僵局，就需要一把能夠快速、準確地判斷任何一個VUS是“油門踩死”(GOF)、“油門失靈”(LOF)還是“無影響”的“萬能鑰匙”。這正是該研究的核心任務。

鑄造“變異分類器”：一把能同時稱量數千個基因“錯字”的天平

面對成千上萬個潛在的VUS，逐一驗證無異於大海撈針。研究人員需要的是一個高通量的解決方案，一個能同時“稱量”數千個基因“錯字”功能效應的“天平”。他們巧妙地將兩項前沿技術結合起來，構建了這個強大的“變異分類器”。

第一件法寶：基因“鉛筆”——鹼基編輯器

傳統的CRISPR-Cas9技術像一把“基因剪刀”，通過切斷DNA雙鏈來進行編輯。但對於只需要修改單個鹼基的VUS來說，“剪刀”顯得過於“暴力”，且修復過程可能引入新的錯誤。研究人員選擇了更為精巧的工具——腺嘌呤鹼基編輯器(adenine base editor, ABE)。它不像剪刀，更像一支神奇的“基因鉛筆”，可以在不切斷DNA雙鏈的情況下，直接將DNA中的一個鹼基A（腺嘌呤）精確地修改為G（鳥嘌呤）。這種“無痕”編輯的方式，完美契合了模擬和研究單點突變的需求。

第二件法寶：高通量篩選的“導航系統”

為了將這支“鉛筆”引導到基因組的特定位置，需要一個“導航員”——向導RNA(single-guide RNA, sgRNA)。研究人員設計了一個巨大的sgRNA文庫，這個文庫包含了數千種不同的sgRNA，每一種都像一個精確的GPS坐標，能夠將ABE“鉛筆”引導到PIK3CD或PIK3R1基因的不同位置，進行A-to-G的修改，從而在細胞內原位生成大量的、不同的基因變異。這個文庫的設計極其周密，覆蓋了這兩個基因74%和69%的氨基酸殘基，理論上可以生成成千上萬種不同的蛋白質變體。

稱量“砝碼”：一個與臨床息息相關的細胞功能讀數

有了工具和導航系統，還需要一個靈敏的“天平”來稱量每個變異的功能後果。研究人員選擇了一個極其巧妙的讀數——T細胞中AKT和S6蛋白的磷酸化水平(pAKT/pS6)。AKT和S6是PI3Kδ信號通路下游的關鍵分子，它們的磷酸化水平直接反映了PI3Kδ這個“油門”踩下的深度。GOF突變會導致pAKT/pS6水平飆升，而LOF突變則會使其降低。更重要的是，這個指標已經被臨床用於輔助診斷APDS，是一個久經考驗、與疾病直接相關的生物標誌物。

研究人員首先在健康人T細胞中驗證了這個“天平”的靈敏度。他們用ABE分別製造了已知的APDS致病GOF突變(p.C416R)和已知的LOF突變(p.S281P)。結果令人振奮：與正常細胞相比，攜帶GOF突變的細胞在受刺激後，其高pAKT/pS6信號的細胞比例增加了12倍；而與攜帶LOF突變的細胞相比，這一比例更是驚人地增加了136倍！這個巨大的動態範圍意味着，這台“天平”極其靈敏，足以分辨出從最強的GOF到最強的LOF之間的細微差別。

篩選流程：讓細胞自己“投票”

萬事俱備，一場大規模的細胞功能篩選開始了。研究人員將sgRNA文庫通過慢病毒載體導入健康人來源的原代T細胞中，然後通過電穿孔技術將ABE“鉛筆”的信使RNA(mRNA)送入細胞。這樣，成千上萬的T細胞就被“編輯”成了攜帶各種PIK3CD或PIK3R1變異的“化身”。接下來，他們模擬了免疫激活的過程，刺激這些T細胞，然後使用流式細胞分選技術(FACS)——一個可以根據細胞表面或內部的熒光標記來分離細胞的強大工具——進行分選。他們設定了兩個“投票箱”：一個“極度活躍”箱（pAKT/pS6信號最強的前15%細胞）和一個“極度沉寂”箱（pAKT/pS6信號最弱的後15%細胞）。分選完成後，研究人員分別提取這兩個“投票箱”里細胞的DNA，通過高通量測序來分析哪種sgRNA（即哪種基因變異）在其中富集了。邏輯很簡單：如果一個變異導致了GOF，它就會被大量“投票”進入“極度活躍”箱；反之，如果導致LOF，則落入“極度沉寂”箱。通過這種巧妙的設計，研究人員將一個複雜的生物學問題，轉化成了一個清晰的、可量化的“富集遊戲”。

從混沌到有序：一張前所未有的基因功能地圖

當測序數據彙集而來，一幅前所未有的基因功能地圖逐漸清晰。這張地圖不僅精確地標記了已知的“地標”，更揭示了大量未知的“新大陸”。

地圖的精準度：經得起考驗

首先，研究人員檢驗了這套系統的準確性。結果堪稱完美：所有已知的、明確致病的APDS相關的GOF突變，如PIK3CD的p.C416R和PIK3R1的p.L573P，都在“極度活躍”箱中表現出極強的富集。在數據庫(ClinVar)中記錄的11個致病或可能致病的變異中，有10個被他們的系統成功識別為顯著的GOF。而33個已知的良性變異，則無一被錯誤地歸類。基於這些已知變異的“金標準”數據，研究人員計算出其篩選方法的“致病性幾率評分”(OddsPath)，對致病變異的評分為26.0，遠超臨床認可的“強證據”標準。這證明了，他們的系統不僅能“看”到變異，更能“理解”變異。

新大陸的發現：點亮百餘個“未知”變異

這張地圖最大的價值在於照亮了“未知”。研究人員成功地為超過100個之前被標記為VUS或從未被注釋過的變異，提供了明確的功能分類。這些新發現的GOF和LOF變異，像一顆顆新星，點綴在PIK3CD和PIK3R1的蛋白結構上。例如，他們在PIK3CD的多個功能域中都發現了新的GOF變異，包括在適配器結合域(ABD)的p.Q80R、C2結構域的p.N334G以及催化域的p.H940R等。同樣，在PIK3R1中，他們也發現了跨越不同結構域的新功能變異。這些發現極大地擴展了我們對APDS致病突變的認知譜。

超越一維視角：三維結構揭示“功能熱點”

研究人員並未止步於一份線性的變異列表。他們將這些功能數據疊加到PI3Kδ複合物的三維蛋白質晶體結構上，這一步帶來了令人驚嘆的洞見。從一維的基因序列上看，一些功能相關的變異可能相距甚遠，甚至位於不同的蛋白質亞基上。但當它們被放置在三維空間中時，研究人員發現它們常常在空間上彼此靠近，形成所謂的“功能熱點”。例如，PIK3CD上的GOF突變p.C416R與PIK3R1上的GOF突變p.K567G和p.L570P，雖然屬於兩個不同的蛋白，但在三維結構中卻緊密相鄰，共同位於兩個蛋白的相互作用界面上。這表明，這些區域對於維持PI3Kδ的正常功能至關重要，任何微小的擾動都可能打破精密的平衡。這種三維視角為理解變異如何影響蛋白質功能提供了直觀而深刻的生化證據。

選擇最佳“標尺”：為何pAKT/pS6優於細胞增殖？

在科學研究中，選擇正確的測量指標至關重要。一些研究可能會使用細胞增殖或存活作為讀數。研究人員也進行了對比，他們發現，雖然PI3Kδ信號也影響T細胞增殖，但使用增殖作為讀數，其信噪比遠低於pAKT/pS6。數據顯示，pAKT/pS6篩選能夠識別出25.3%的sgRNA具有顯著功能，而增殖篩選只能識別出15.9%。更重要的是，一些已知的致病GOF突變，如PIK3CD的p.E1025G，在增殖篩選中完全“隱身”，但在pAKT/pS6篩選中則清晰可見。這證明了選擇一個與通路活性直接相關的、靈敏的讀數是多麼關鍵，它決定了我們能否捕捉到所有重要的生物學信號，尤其是那些效應較為溫和但同樣具有臨床意義的變異。

細胞的“模仿秀”：工程細胞如何揭示疾病真相與藥物的秘密

破譯了基因密碼的含義只是第一步，更重要的是理解它如何影響疾病的發生，以及如何指導治療。研究人員利用他們精確編輯的T細胞，上演了一場精彩的“模仿秀”，完美復刻了APDS患者體內的病理狀態和對藥物的反應。

復刻疾病表型：T細胞的“衰竭”狀態

在之前的研究中，人們發現APDS患者的T細胞表現出一種“細胞衰竭”(cellular exhaustion)的狀態。這些細胞表面布滿了抑制性受體，如PD-1和CTLA-4，內部則高表達衰竭相關的轉錄因子TOX，而維持T細胞“乾性”和記憶能力的關鍵轉錄因子TCF1則顯著下調。這使得患者的免疫系統雖然看似“過度活躍”，實則“外強中乾”，無法有效清除感染。研究人員在他們工程改造的T細胞中也觀察到了完全相同的現象。攜帶GOF變異的T細胞，其PD-1、CTLA-4和TOX水平顯著升高，而TCF1水平則降低。這證明了他們構建的細胞模型能夠忠實地模擬疾病的核心病理生物學特徵。

藥物測試：Leniolisib的敏感與抵抗之謎

Leniolisib是FDA批准的全球首個專門用於治療APDS的靶向藥物，它是一種選擇性的PI3Kδ抑製劑，能夠直接作用於過度活躍的信號“油門”。研究人員用Leniolisib處理了他們攜帶各種GOF變異的工程T細胞。結果顯示，絕大多數GOF變異都對Leniolisib高度敏感。用藥後，飆升的pAKT/pS6信號被有效抑制，T細胞的“衰竭”表型也得到了逆轉。

然而，一個意外的發現浮出水面。研究人員注意到，在PIK3R1基因的一個特定區域——SH2間結構域(inter-SH2, iSH2)——內的一簇GOF變異，包括p.K567G、p.L570P和p.L573P，表現出了部分耐藥性。儘管Leniolisib能夠降低它們的pAKT信號，但在pS6信號的抑制上效果較差，並且這些細胞在用藥後仍然保留了相對較高的衰竭標誌物水平。這個發現具有重大的臨床意義。它首次揭示了不同APDS致病突變之間可能存在藥物敏感性的差異，並精準地定位了耐葯相關的“熱點區域”。這意味着，攜帶iSH2結構域變異的患者，可能對Leniolisib單葯治療的反應不如其他患者。

來自真實世界的驗證：患者樣本的最終確認

為了驗證上述發現，研究人員獲得了兩位真實APDS患者的T細胞樣本，他們的基因型恰好為這一假說提供了絕佳的驗證機會：患者1攜帶PIK3CD的GOF突變(p.E1021K)，屬於Leniolisib敏感類型；患者2攜帶PIK3R1的GOF突變(p.N564K)，該突變正位於預測的耐葯熱點iSH2結構域內。實驗結果與預測驚人地一致。兩位患者的T細胞都表現出與工程細胞相同的信號亢進和衰竭表型。在使用Leniolisib治療後，患者1的T細胞功能得到了很好的恢復。然而，患者2的T細胞，在PD-1和CTLA-4等衰竭標誌物的抑制上，效果明顯弱於患者1。這一來自真實世界的直接證據，強有力地證實了他們基於高通量篩選和工程細胞模型得出的預測：不同基因型的APDS患者，對靶向治療的反應可能存在差異。

破解耐葯密碼，重塑“罕見”定義

發現了部分耐藥性，研究的腳步並未停止。他們繼續探索如何克服這一挑戰，並着手回答一個更大膽的問題：APDS，這個被認為是百萬分之幾發病率的罕見病，真的有那麼罕見嗎？

聯合療法的“組合拳”：克服耐藥性的新策略

既然Leniolisib單葯對iSH2變異的效果打了折扣，那麼“組合拳”是否會更有效？研究人員將目光投向了PI3Kδ信號通路的下游。mTOR是PI3Kδ通路下游的一個核心激酶，控制着細胞的生長和代謝。既然Leniolisib抑制“上游”不夠徹底，那麼同時用另一種藥物抑制“下游”的mTOR，是否能實現更完全的通路阻斷？他們測試了Leniolisib與兩種mTOR抑製劑——雷帕黴素(rapamycin)或依維莫司(everolimus)——的組合。結果非常成功。在攜帶耐藥性PIK3R1變異的工程細胞和患者2的T細胞中，聯合用藥相比於單用Leniolisib，能夠更強效地抑制pS6信號，更徹底地逆轉T細胞的衰竭表型，將細胞功能恢復到接近正常的水平。這不僅為潛在的耐葯患者提供了一個合理的、有數據支持的備選治療策略，也再次凸顯了這種功能基因組學方法在指導新葯組合開發方面的價值。

重新審視“罕見”：在人群數據庫中尋找“失落的病例”

研究的最後一個篇章，也是最令人震驚的部分，是關於APDS患病率的重新評估。憑藉手中這份詳盡的、經過功能驗證的GOF變異列表，研究人員得以在大型人群基因組數據庫中進行精確的搜索。他們查詢了多個數據庫，包括一個8,453名疑似IEI患者的隊列，以及一個包含超過63萬普通人的“我們所有人”(All of Us)研究計劃數據庫。結果令人瞠目：在IEI隊列中，他們發現了27名患者攜帶他們新發現的GOF變異；在“我們所有人”普通人群數據庫中，他們找到了123名GOF變異的攜帶者。進一步分析發現，這些攜帶者患上各種免疫介導疾病的風險顯著高於非攜帶者。這些數據強有力地表明，許多之前被忽視的VUS實際上是具有致病潛力的GOF變異，它們在人群中的存在遠比想象的要普遍。

基於這些發現，研究人員做出了一個大膽的估算：在人群中，攜帶潛在致病性PIK3CD/PIK3R1GOF變異的頻率可能高達1/5000！這個數字，比之前公認的1-2/百萬的患病率，高出了一到兩個數量級。這意味着，APDS可能根本不是一個極端罕見的疾病，而是一個被嚴重低估和漏診的疾病。大量的患者可能因為其癥狀不典型，或者因為他們的基因變異被錯誤地歸為“未知意義”，而錯過了診斷和精準治療的機會。

從一個基因到整片星空：精準醫學的未來已來

回顧這項研究，我們彷彿跟隨研究人員完成了一場精彩的破案之旅。他們從基因測序帶來的“VUS困境”出發，利用鹼基編輯和高通量篩選技術，鑄造了一把強大的“變異分類器”。他們用這把鑰匙，系統性地破譯了PIK3CD和PIK3R1兩個基因上百餘個“神秘字符”的含義，繪製出了一幅前所未有的高分辨率功能地圖。這張地圖不僅幫助我們理解了疾病的分子機制，還意外地揭示了不同基因型對靶向藥物敏感性的差異，並指導了克服耐藥性的聯合治療策略。最終，通過將實驗室的發現與大規模人群數據相結合，他們顛覆了我們對一種“罕見病”流行率的傳統認知。

這項工作的意義遠遠超出了APDS本身。它建立了一個從“變異到功能，再到臨床”的完整研究範式。這個範式可以被廣泛應用於數百種其他的先天性免疫缺陷，乃至更多由單基因變異引起的遺傳病。它為解決長期困擾基因診斷的VUS問題提供了一個可擴展的、強有力的解決方案。

未來，我們可以想象，當醫生在患者報告上看到一個VUS時，他們不再需要束手無策地等待。他們可以查詢一個動態更新的、由類似功能篩選實驗構建的“變異功能數據庫”。這個數據庫會明確告知他們，這個變異是GOF、LOF還是中性，它對特定藥物的敏感性如何，甚至推薦潛在的聯合治療方案。這不再是科幻小說中的場景。這項發表在《細胞》上的研究告訴我們，通過巧妙的實驗設計和前沿技術的融合，我們正在一步步將這個願景變為現實。精準醫學的未來，一個真正為每個個體“量身定製”診療方案的時代，已經伴隨着這些基因“破譯者”的腳步，悄然到來。

參考文獻

Walsh ZH, Frangieh CJ, Kothapalli N, Levy J, Heck CK, Melms JC, Gejman RS, Shah P, Pollard JM, Naik A, Grauman SL, Huang LH, Lee A, Bogunovic D, Milner JD, Izar B. Scalable generation and functional classification of genetic variants in inborn errors of immunity to accelerate clinical diagnosis and treatment. Cell. 2025 Jun 19:S0092-8674(25)00624-5. doi: 10.1016/j.cell.2025.05.037. Epub ahead of print. PMID: 40543502.

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