今天推送的文章發表在J Agric Food Chem.上的“Crystal Structure of Levansucrase from the Gram-Negative Bacterium BrenneriaProvides Insights into Its Product Size Specificity”，作者為江南大學食品學院的沐萬孟教授。
果聚蔗糖酶屬於糖苷酶68家族(GH 68)，在G+和G−細菌的蔗糖利用過程中起關鍵作用。LSs從蔗糖中合成主要通過β-(2，6)果糖鍵形成的果聚型低聚果糖(FOS)和果聚型聚合物。值得注意的是，與來自G-細菌的酶相比，從G+細菌中分離的LS酶產生更長的果聚糖作為其主要產物。
LSs採用的機制包括斷裂蔗糖的α1-β2糖苷鍵並將其果糖基單元轉移到含有果糖基的受體（轉果糖基化，縮寫為T反應）或水（水解，縮寫為H反應）。除了細胞壁組成以及酶和底物濃度等環境條件外，LS酶本身中底物位點的空間組織部分決定了T和H反應之間的比率(T/H)，因此也決定了最終產物的長度。迄今為止，僅發表了少數幾個LSs的3D結構；兩個G+細菌包括來自B.subtilis和Bacillus megaterium的LSs，以及三個G−細菌，包括來自G.diazotrophicus，E.amylovora和Erwinia tasmaniensis的LSs。它們都採用共同的五葉片β螺旋槳作為其催化域，而主要區別在於連接葉片內部和葉片之間的β鏈的環。一個深的帶負電荷的口袋位於β-螺旋槳結構域的底部，用於蔗糖結合。作為G+細菌LS的代表，Bs-SacB(E324A)與蔗糖的複合物在−1和+1亞基周圍有3個催化殘基D86、D247和E342，分別被指定為親核劑、過渡態穩定劑和一般酸鹼。
蔗糖結合位點(−1和+1亞位)周圍的某些殘基的突變會降低酶的活性和產物的合成。此外，距離活性位點較遠的殘基的突變也會影響產物譜，例如Bacillus megateriumLS(Bm-LS)的突變體Y247A、Y247W、N252A、D257A和K373A。事實上，在最近的一項研究中，通過酶(D86A/E342A突變體)與果聚型FOS(6，6，6，6，6，6，6-酮辛糖)的共結晶複合體觀察到了Bs-SacB中遠程果聚FOS結合位點(OB1和OB2)的影響。Bs-SacB中+2，+3和+4亞基附近殘基的突變只是減小了低分子質量（LMW）果聚糖的大小，而不是HMW果聚糖大小。這進一步支持了解LS產物大小特異性的潛在機制對於實現定製的果聚糖合成的相關性。
為了更深入地了解Brs-LS的產物專一性和LSs的結構−功能關係，特別是關於產物大小的特異性，作者對Brs-LS突變體H327A和A154S的產物譜進行了更詳細的分析。此外，還測定了野生型Brs-LS、突變體H327A、A154S以及與供體底物蔗糖形成的複合體的失活突變體(D68N)的晶體結構，這是首次對G−-LSs進行結構表徵。這些結構證實了殘基A154和H327在Brs-LS合成聚合物中的重要作用，表明它們的突變是如何影響酶活性部位附近的基本相互作用的。
H327A和A154S的產物譜
HPLC分析表明，與野生型Brs-LS相比，A154S突變體能夠產生HMW果聚糖(圖1)。在該圖中，包括多糖以及果聚糖的寡糖作為產物。事實上，A154S突變體產生的多糖的Mw約為106−107Da，比Brs-LS寬一點。令人驚訝的是，突變體H327A未能產生任何HMW果聚糖；甚至蔗糖濃度增加到60%。當反應達到平衡時，除了蔗糖、葡萄糖和果糖外，還會生成一系列聚合度較低的FOS(DP≤6)。H327A突變體合成的果寡糖主要是三糖6-酮糖，是最簡單的Levan型FOS。
Brs-LS的晶體結構
Brs-LS的晶體結構採用典型的GH68摺疊；與先前構建的同源模型(20)疊加表明，除了一些外環外，它們非常相似。Brs-LS的球形催化結構域由殘基64−422組成，是一個5葉β-螺旋槳結構(圖2a，b)，這是GH68家族酶的典型結構特徵。每個葉片由四條反平行的β鏈(稱為A−D)組成；有時，C或D鏈被分成兩條短的β鏈。葉片形成一個漏斗，在Brs-LS的底部有一個很深的口袋(圖2c)，其中有三個建議的催化殘基D68、D225和E309。活性中心漏斗的內壁主要排列着每個葉片的第一條和第二條β鏈，而催化結構域的外部主要由每個葉片的第三條和第四條β鏈組成。活性部位漏斗的邊緣由來自四個結構元件的殘基排列：(A)連接鏈1B-1C的環中的螺旋α1(環1)，(B)連接鏈2D-3A的環4，(C)連接鏈4B-4C的環7，以及(D)連接鏈5B-5C的環9。
Brs-LS結構更類似於G−細菌LS，而不是G+細菌LS。與Brs-LS最接近的結構同系物是G−細菌Ea-LS和Et-LS。事實上，所有次級結構元素幾乎完美地疊加在一起，連接環和環的長度也非常相似(圖3a)。與Ea-LS相比，在漏斗內的環路中，Brs-LS中有五個殘基不同：N116、Y220、A222、F329和Y371，分別取代了E94、F198、N200、T307和F349(圖3b)。Brs-LS與代表G+細菌LSs的Bs-SacB和Bm-LS的疊加顯示出更顯著的差異，主要發生在連接每個葉片內和之間的β鏈的環中，以及包括漏斗邊緣的元件(圖3c)。
活性部位(野生型)
活性中心(−1和+1)位於β-螺旋槳催化結構域的中心，形成一個深口袋，容納多個水分子和−1亞基中的甘油分子。從序列比對和活性分析來看，位於葉片1(D68)、3(D225)和4(E309)的第一β鏈上的三個殘基先前被確認為Brs-LS的催化三聯體。催化殘基參與了一個廣泛的氫鍵網絡，涉及幾個水分子、甘油以及殘基R224、R310、Y374和S375。殘基S375具有雙重構象，可以與R310相互作用，也可以與催化親核試劑D68相互作用。催化酸鹼E309也呈雙構象。在催化三聯體的5 Å範圍內，存在另外6個殘基(W67、W153、A154、Q307、I325和H327)(圖4a)。這些殘基相對於其他G-細菌的LS，包括Gd-LS和Ea-LS，在殘基類型和構象方面是保守的。相反，與G+細菌LSsBs-SacB和Bm-LS相比，Brs-LS中這六個位置中有四個位置不同：A154(G+LS中的絲氨酸)、Q307(谷氨酸)、I325(天冬氨酸)和H327(精氨酸)(圖4b)。
活性部位(突變體D68N與蔗糖複合)
Brs-LS的D68N突變體對蔗糖無活性。來自浸泡了50 mM蔗糖的晶體的2Fo-Fc和Fo-Fc電子密度圖(1.35 Å分辨率)表明活性中心中存在蔗糖，儘管果糖基環的密度不太明確；因此，蔗糖佔有率被設置為0.70以獲得最佳的精製結果。Polder類型的omit圖(圖5a)證實了底物的存在。Brs-LS蔗糖複合物與BsSacB(PDB：1PT2)的重疊顯示出幾乎相同的結合方向。底物的果糖和葡萄糖部分通過幾個直接氫鍵作用與酶緊密結合。詳細地說，果糖基的O1/與兩個D68N側鏈構象之一的Oδ1發生氫鍵作用，而O3和O4羥基通過D225 Oδ1和Oδ2的氫鍵穩定。突變的催化親核試劑(D68N)的另一個側鏈構象從蔗糖指向A154和R310，但沒有發生任何氫鍵作用。值得注意的是，糖苷氧以及葡萄糖O2和果糖O/通過氫鍵與E309相互作用，將這種催化酸/鹼放置在合適的方向上，向糖苷鍵提供質子。E309側鏈的取向通過與R224和Y374的氫鍵相互作用進一步穩定，這兩個殘基都是保守的殘基。在D68N突變體中沒有觀察到其他顯著的結構變化。
除催化殘基外，其他殘基包括W67、H119、R224、Q307、H327和S375以及A154的主鏈氮原子也與蔗糖相互作用(圖5b)。在這些殘基中，涉及W67、R224、D225和S375的相互作用與Bs-SacB蔗糖複合體結構保守；這些殘基分別位於高度保守的基序-VWD-、-RDP-和TYSH中。另外兩個殘基Q307和H327不同於G+細菌LS中發現的殘基(例如Bs-SacB的E340和R360)，與BsSacB中的情況相似，它們仍然與蔗糖的葡萄糖部分的O2和O3基團提供氫鍵相互作用。
突變體H327A
將野生型Brs-LS和突變體H327A的結構疊加，RMSD值為0.078 Å，表明這兩種結構之間有很高的相似性。H327組氨酸環的存在有助於形成漏斗的這一側(圖6a)，從而定義底物結合空間，並可能影響果糖轉移效率。值得注意的是，雖然在野生型結構中，H327被“夾在”Y374和F329的內向構象之間，但H327A突變體缺乏雜環組氨酸環，π−π堆積相互作用不再可能。結果，在突變體H327A中，只觀察到F329的外向構象(圖6b)。總而言之，組氨酸環的缺乏和苯丙氨酸的首選向外構象導致了+1亞位附近更寬的空間(圖6c)。
突變體A154S
野生型Brs-LS和A154S突變結構的疊加，RMSD為0.105 Å。值得注意的是，在突變結構中，觀察到了S154的兩種不同構象(圖7)。兩個Ser側鏈構象中的一個與過渡態穩定殘基D225(以及與水W149)產生氫鍵；另一個S154側鏈構象參與與D68 OD2的氫鍵作用，從而略微重新定位其側鏈(0.5 Å OD2)。值得注意的是，與D68N蔗糖複合體不同，D68側鏈具有單一構象，面向−1亞基。最後，A154S的主鏈氮原子與甘油的O3原子發生氫鍵作用；在野生型和H327A結構中，水分子處於同一位置，而在D68N蔗糖絡合物中，氫鍵作用是與果糖基O4/。
整理：孫驍
文章信息：
DOI：10.1021/acs.jafc.2c01225
文章鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.jafc.2c01225
