撰文丨萧平
顾名思义，细胞外游离DNA (cell-free DNA, cfDNA) 由细胞外DNA片段组成，可以通过血浆或血清获得。在健康个体中，其主要来自血细胞的死亡。在不同的生理和病理状态下，cfDNA能够发生改变。例如，在癌症患者中，一部分cfDNA来自于肿瘤细胞，对这部分被称为循环肿瘤DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) 的DNA进行序列分析，能够揭示肿瘤特异性的基因改变。基于cfDNA分析的液体活检 (liquid biopsy) 为无创性诊断提供了新的策略【1-3】。
在血浆中，cfDNA主要以核小体 (cf核小体) 的形式存在。核小体是染色体的基本组成单元，其由~150 bp的DNA包裹组蛋白八聚体形成，在DNA序列信息之外，组蛋白不同化学修饰的组合赋予了核小体组织特异性的表观遗传信息，并提供了细胞内基因表达和调控的状态。证据表明，cf核小体上保留了部分表观遗传信息，通过ChIP-seq，其上的表观信息可以被解读【4】。
虽然目前的方法就能够让我们获得血浆中cf核小体的表观遗传信息，但它们有很大的局限性。主要来说，相关检测的样本需求量大、检测范围有限、成本较高，同时，获得的信息有限，且分辨率较差，例如，通常只能得到单一的观测信息 (例如单一的修饰分布，或者核小体占位情况)。因此，高分辨率的、整合不同层面信息的检测方法是亟需建立的。
近日，以色列魏茨曼科学研究所Efrat Shema课题组在Nature Biotechnology发表题为Multiplexed, single-molecule, epigenetic analysis of plasma-isolated nucleosomes for cancer diagnostics的研究论文，开发了一种基于单分子成像的液体活检方法——EPINUC，该技术能够从少于1 mL的血浆样本中分析多个表观遗传信息参数。进一步地，研究人员利用该检测方法，结合蛋白质生物标志物的高灵敏度检测，证明了其在结直肠癌诊断中的重要价值。
首先，基于前期建立的利用全内反射显微镜成像技术 (Total internal reflection microscopy. TIRF) 观测组蛋白修饰组合的单分子成像体系【5】，研究人员开发了EPINUC (Epigenetics of plasma-isolated nucleosomes) 技术 (见图1，具体流程参见图注)。
图1 技术路线图。a. cf核小体的样品制备过程。这一过程包含两个酶促反应，分别是通过Klenow聚合酶修复DNA末端，以及通过末端转移酶添加poly(A)尾。这一过程中使用dATPs和荧光标记的dATPs (Cy3-dATP) 的混合物，用于标记核小体。b. cf核小体通过dA:dT杂交被固定在PEGylated-poly(T) 表面，继而与靶向不同组蛋白修饰的荧光标记抗体孵育，进行修饰的标记。c. 利用TIRF显微镜记录核小体位置，生成抗体结合事件的延时成像。
研究人员对抗体的特异性以及结合线性进行了检验，最终确认了6支抗体适用于EPINUC体系，分别是表征转录激活状态的H3K4me3、H3K36me3和H3K9ac，表征转录抑制以及异染色质状态的H3K9me3和H3K27me3，以及表征增强子的H3K4me1。实验过程中，核小体被Cy3 (绿色) 标记，两种组蛋白修饰的组合能分别被AF488 (蓝绿色) 和 AF647 (红色) 标记。在同一观测体系下，具有特定组蛋白修饰核小体的比例、核小体上不同组蛋白修饰的占比差异以及不同的组蛋白修饰在同一个核小体上的共同标记情况能够被记录和分析 。通过对同一样品的多次检测，这一方法的重复性/稳定性也得到了验证。EPINUC是首个利用小体积样本 (<1 mL) 进行单分子精度核小体修饰特征检测的技术。
在此基础上，为了获取更多的评估参量，研究人员利用单分子系统，增加了对蛋白质生物标志物和DNA甲基化水平的评估和量化 (见图2) 。
图2 技术路线图。a. 蛋白标志物检测。首先将靶向不同蛋白的生物素化的抗体锚定在PEG–链霉亲和素表面，继而通过孵育，捕获血浆中的相应蛋白，最后利用荧光标记抗体和TIRF成像进行检测。这一方案可完成3种蛋白质的同时检测。b. DNA甲基化检测。首先对生物素化的MBD2和Cy3标记的cfDNA进行孵育，前者能够特异性结合于携带有甲基化修饰的后者，继而通过同PEG–链霉亲和素孵育，生物素-MBD2-甲基化的cfDNA被锚定在PEG–链霉亲和素表面，进而进行TIRF成像。每个成像点代表一个单一的结合复合体，点的数量对应血浆中DNA甲基化的水平。
建立了以上的检测平台，研究人员应用EPINUC，从来自33个健康个体和40个晚期CRC患者 (术前或进行手术切除和化疗后) 的血浆样本中，获得了三个层面——组蛋白修饰、DNA甲基化以及蛋白质生物标志物——的诊断信息。癌胚抗原 (CEA) 在CRC患者血浆中水平升高，是临床上经典的生物标志物【6】。通过单分子成像计数，CRC个体中CEA水平较高，手术切除后患者CEA水平有所降低。但值得注意的是，在少数健康个体中也观察到较高水平的CEA 。同时探测MST1，进行CEA/MST1比值测定，能够更好地对样本进行诊断，展现了组合生物标志物检测的优势所在。另外，手术切除后患者血浆CEA/MST1比值与未切除的CRC患者相比有所改变，且与健康人血浆具有更高的相似性，说明这一检测在监测治疗预后方面的潜在价值。
EPINUC还提供了包括cf核小体总数、6个组蛋白修饰及它们的成对组合在每个血浆样本的比值的定量测量。与相关报道相一致，CRC患者的血浆cf核小体高于健康对照组。可以看到，虽然大多数表观遗传修饰及其参数没有变化，但有几个参数存在显著差异：CRC患者H3K27me3、H3K9me3、H3K9ac和H3K4me1修饰的核小体水平较高；H3K9ac/H3K4me1的比值较高 。值得注意的是，在CRC中，H3K9me3和H3K36me3共同修饰的核小体比例减少，伴随着以H3K4me3和H3K27me3为标志的“二价 (bivalent’)”核小体比例的增加，这一结果同经典的认知不谋而合。此外，CRC样本中DNA甲基化水平降低，与之前的研究也是一致的 。
晚期CRC表观遗传和生物标志物的改变促使研究人员将关注点放在EPINUC是否适用于早期CRC (I、II期)的诊断，利用17个血浆样本，他们发现，与晚期CRC一样，早期患者与健康个体之间DNA甲基化水平、CEA、CEA/MST1比值差异性显著 。值得注意的是，I期、II期CRC患者血浆中H3K27me3和H3K9me3修饰的核小体水平升高，和晚期CRC中的观察相同 。另外，我们没有在早期CRC中观察到cf核小体水平的升高，这可能与肿瘤负荷较低有关。虽然H3K4me1和H3K9ac修饰的核小体的水平与健康组无显著差异，但早期CRC患者H3K4me1和H3K9ac共同修饰的核小体比例低于健康个体。以上结果表明，CRC早期患者的cf核小体已经发生了各种表观遗传信息的改变。进一步地，对胰腺导管腺癌患者血浆样品的检测、分析证明，EPINUC以其多层次、多维度信息获取的优势能够助力多种癌症的诊断。
为了对上述结果进行可视化呈现，研究人员进行了主成分分析 (PCA)。PCA显示出了各组之间的空间距离，其中，早期CRC患者样本位于健康个体和晚期CRC患者样本之间，可能反映了一种过渡关系 。紧接着，研究人员利用机器学习，最佳的预测模型呈现出优于单纯依赖蛋白质生物标记物、生物标志物组合DNA甲基化抑或生物标志物组合组蛋白修饰的诊断性能 ，其灵敏度为92% (95% CI为89.3-94.7)，特异性为85% (95% CI为80.2-89.8)，精确度为92% (95% CI为89.7-94.3)。
图3 技术路线图。组蛋白信息的获得如前文所述，简言之，即通过dA:dT杂交对cf核小体进行锚定，继而通过携带有荧光标记的组蛋白特定修饰抗体进行孵育、成像。紧接着，通过增加盐浓度，去除掉组蛋白，原位暴露完整DNA，再进行依赖TIRF成像的单分子测序过程，获得DNA序列信息。
最后，研究人员结合单分子DNA测序技术，开发了EPINUC–seq技术 (见图3)，利用不同组织表观遗传修饰的不同，探讨了通过检测、确认cf核小体的起源组织，判断肿瘤始发位置的可能。
这一工作开发了EPINUC单分子检测技术，将其应用于液体活检，以单分子精度对多层次的诊断信息，包括组蛋白和DNA修饰以及蛋白质生物标志物，进行检测，可以高度特异和敏感地区分CRC患者和健康人群。显见地，这一技术极大地拓宽了液体活检领域，并具有应用于肿瘤早期诊断和预后监测的潜力。
原文链接:
https://www.nature.com/articles/s41587-022-01447-3
制版人：十一
参考文献
1. Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S. & Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nat. Rev. Genet. 20, 71–88 (2019).
2. Lo, Y. M. D., Han, D. S. C., Jiang, P. & Chiu, R. W. K. Epigenetics, fragmentomics, and topology of cell-free DNA in liquid biopsies. Science 372, eaaw3616 (2021).
3. Shen, S. Y. et al. Sensitive tumour detection and classification using plasma cell-free DNA methylomes. Nature 563, 579–583 (2018).
4. Sadeh, R. et al. ChIP–seq of plasma cell-free nucleosomes identifies gene expression programs of the cells of origin. Nat. Biotechnol. 39, 586–598 (2021).
5. Shema, E. et al. Single-molecule decoding of combinatorially modified nucleosomes. Science 352, 717–721 (2016).
6. Tiernan, J. P. et al. Carcinoembryonic antigen is the preferred biomarker for in vivo colorectal cancer targeting. Br. J. Cancer 108, 662–667 (2013).
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