了解自噬研究的经典思路

自噬是热点热点之一。现解读一下“炎症性相关疾病中的自噬”在课题设计中研究思路。

一、研究背景

非小细胞肺癌（NSCLC）是一种常见的恶性肿瘤，肺癌患者从诊断时起的平均生存时间很短。因为由于肿瘤扩散、侵袭、远处转移和对化疗药物的敏感性有限，治愈性治疗通常不可行。因此，探讨“提高非小细胞肺癌抗肿瘤药物敏感性的机制”已成为当务之急。

自噬在细胞的生长、发育、分化、衰老、耐药和细胞死亡等过程中起着重要作用。自噬，即可抑制肿瘤，也可以促进肿瘤在营养有限和低氧条件下生存。

YBX1（Y-box binding protein 1）是一种多功能蛋白，通过与靶基因启动子处的倒置的CCAAT盒结合来调控转录，在肿瘤侵袭转移、耐药、细胞增殖和DNA修复等方面发挥重要的促癌作用。最近的研究表明，YBX1与妊娠期肝内胆汁淤积症的自噬有关。然而，YBX1与NSCLC自噬的关系及其分子机制尚未阐明。

在本研究中，作者发现：① 自噬相关蛋白 LC3I/II 的表达与 NSCLC 组织样本和细胞中 YBX1 的表达密切相关，根据假设，LC3I/II 受 YBX1 控制；② YBX1的过表达会导致体外和体内自噬的上调；③ YBX1 的敲低通过调节自噬，增强了顺铂的抗肿瘤作用；④ YBX1 能通过p110β/Vps34/beclin1通路促进自噬，这表明 YBX1/p110β/Vps34/beclin1 轴参与了癌症的发展和 NSCLC 的进展。

二、研究方法及结果

1. YBX1和自噬相关蛋白LC3I/II在NSCLC病人中的差异表达

作者首先利用western immunoblot分析NSCLC患者组织及NSCLC细胞中的YBX1和LC3I/II在NSCLC表达量，结果发现两种蛋白都高表达，说明YBX1与自噬有关。

2.YBX1促进自噬的发生

作者分别构建了YBX1过表达 A549、Hcc827细胞和敲减的H1299、H460细胞，利用western immunoblotting、自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)和自噬诱导或者抑制剂分析YBX1与自噬的关系。

首先，western immunoblotting分析发现，YBX1的表达量降低显著抑制了LC3I/II的表达量，在过表达的细胞中发现了相反的现象。接着，利用免疫荧光和透射电镜的超微结构分析感染了GFP-LC3中Autophagosome的形成情况，发现YBX1促进了自噬Autophagosome的形成。最后，利用自噬诱导或者抑制剂分析YBX1过表达和敲减的细胞系中GFP-LC3或GFP-LC3II转换，发现YBX1过表达能促进GFP-LC3的形成。

3.YBX1介导自噬的机制分析

自噬的信号通路有PI3K/Akt/mTOR 和 p110 β/Vps34/beclin1，通过分析在YBX1过表达和敲降细胞系中关键信号分子的表达量，作者确定YBX1是通过调节p110 β/Vps34/beclin1来控制自噬的发生。

考虑到YBX1是一个著名的转录激活子，所以通过进一步Jaspar分析得知，YBX1是通过与p110β启动子结合来发挥作用，并通过pulldown assay进一步验证了两者的结合关系。为了进一步确定“YBX1调节p110β是在转录水平而不是在蛋白质水平”，作者利用actinomycin D来抑制 RNA polymerase I的YBX1过表达的肿瘤细胞中p110β的表达水平，结果发现YBX1的高表达并没有引起p110β mRNA的显著性衰减。通过回复实验，作者进一步验证了YBX1-mediated p110β的自噬。

4. YBX1通过诱导自噬作用降低顺铂介导的NSCLC细胞增殖抑制和促进细胞凋亡的作用

已知YBX1在顺铂耐药细胞系中明显高于敏感细胞系，研究者进一步用顺铂处理NSCLC细胞系，发现YBX1, LC3I/II conversion的增长趋势呈时间依赖性。用顺铂处理YBX1过表达和敲降细胞系时发现，YBX1显著降低顺铂介导的细胞活性抑制作用同时能够抑制细胞凋亡。在敲降的细胞系中，作者也发现了C-Caspase 3/9的表达量增加，而Bcl-2 和Caspase 3表达量降低，说明凋亡被激活。该结果表明，敲除YBX1可增强顺铂在非小细胞肺癌中的抗增殖作用。

为了进一步研究 YBX1 调节NSCLC对顺铂的敏感度的机制，作者在YBX1敲降细胞中进一步降低了Bcl-2的表达，发现在NSCLC细胞中同时敲降掉YBX1和 Bcl-2能够显著增加对药物的敏感度。

已经有文献表明，Bcl-2作为一个抗凋亡蛋白通过beclin1来抑制自噬的发生。作者进一步检测了YBX1敲降能够引起Bcl-2和LC3I/II降低，而Bcl-2降低能够更加显著的增加LC3I/II的表达量，说明YBX1调节的NSCLC细胞对顺铂的敏感度与自噬有关。

5.体内实验

研究者使用皮下注射构建YBX1过表达小鼠模型，分析小鼠移植瘤变化。然后加入顺铂处理小鼠，发现YBX1过表达的老鼠对顺铂的敏感度较低。IHC、WB检测肿瘤块中YBX1的表达量。其结果显示YBX1过表达显著增加了p110β, beclin1, LC3I/II的表达量。

6.临床样本检测

作者利用IHC检测YBX1和LC3I/II在肺癌组织中的表达量与患者预后的关系，发现YBX1高表达生存率小，但是LC3I/II对患者的预后没有相关性。另外，还观察到YBX1与LC3I/II 的正向关系。

四、总结

本研究证明，NSCLC 细胞和组织标本 YBX1 和 LC3I/II表达显著增高。YBX1 过表达后，在体外和体内都显着促进自噬。YBX1 通过部分诱导自噬来降低对顺铂的敏感性，而不仅仅是通过增加 Bcl-2 的表达。

进一步的综合分析表明， p110β 是受 YBX1 调节以介导自噬的关键效应物。这些分析说明了 p110β/Vps34/beclin1 信号在自噬中的关键作用以及 p110β 在 YBX1 介导的 p110β/Vps34/beclin1 转录调控中的不可或缺的关系。作者首先通过体内体外实验证实YBX1过表达能促进自噬，然后发现YBX1通过诱导自噬降低了对顺铂的敏感性，最后研究进一步的机制：YBX1通过p110β/Vps34/beclin1进行转录调节。整个研究思路非常清晰经典，值得大家学习。

来源：https://www.nature.com/articles/s41419-020-2555-4#Sec18