人基因组中存在大量重复序列，包括长散布核元件-1（LINE-1）逆转录转座子，人内源性逆转录病毒（HERV），卫星重复序列等。
正常发育过程中，重复序列主要在胚胎发育期间表达，在已分化的组织中被抑制[1]。而在肿瘤的发生发展过程中，重复序列异常表达[2]，而且这些异常表达的重复序列RNA可逆转录为DNA，导致肿瘤细胞胞浆DNA积累，从而激活cGAS-STING通路促进肿瘤进展[3]。
这意味着抑制逆转录酶活性，可能影响肿瘤进展和转移播散。实际上，核苷类逆转录酶抑制剂目前已经在临床上用于治疗HIV和HBV感染。那么，这些药物能否用于对付肿瘤呢？
近日，由美国哈佛大学医学院附属麻省总医院David T. Ting和Benjamin D. Greenbaum领衔的研究团队，在著名期刊Cancer Discovery杂志发表的最新研究[4]，回答了前述问题。
他们利用核苷类逆转录酶抑制剂拉米夫定（3TC）在结直肠癌模型中进行了功能研究和机制探索，并在转移性结直肠癌患者中进行临床试验，发现3TC具有抑制肿瘤进展的潜力。
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实际上，Ting团队之前研究过核苷类逆转录酶抑制剂扎西他宾（ddC）和司他夫定（d4T）在体内外抑制结直肠癌细胞生长的效果，虽然这两个药物也有效果，但是这些早期的核苷类逆转录酶抑制剂对患者有严重副作用[5]。这显然不适合应用于临床。
为了找到有疗效，且副作用小的逆转录酶抑制剂，这一次他们选择了3TC进行试验。这是因为已有研究证明3TC具有抑制内源性逆转录酶活性的潜力，而且HIV和HBV患者对这个药物的耐受良好。
考虑到肿瘤细胞的迁移和避免离开大本营自发凋亡（失巢凋亡）的能力是肿瘤转移必需的。因此研究人员首先进行了Transwell迁移实验和软琼脂克隆形成实验，探究3TC对10种结直肠癌细胞系（p53突变型：DLD1，HCT15，HT29，C2BBe1，LS123和SW948；p53野生型：HCT8，HCT116，LOVO和RKO）转移的影响。
Transwell迁移实验结果表明，3TC显著抑制DLD1，HCT15，C2BBe1，LS123和RKO细胞系迁移。不难发现，3TC主要作用于p53突变型细胞系。软琼脂克隆形成实验也观察到类似的结果。进一步，研究人员发现3TC对p53突变型SW620荷瘤小鼠有疗效，而对p53野生型HCT116荷瘤小鼠无效。
(L)和(M)分别是p53突变型（SW620）和野生型（HCT116）结直肠癌荷瘤小鼠给予3TC或PBS处理后肿瘤生长曲线。
观察到3TC主要对p53突变型细胞系或荷瘤小鼠有效后，研究人员接着探究p53是否对重复序列表达有直接影响。
研究人员在p53突变型（SW620，DLD1）和野生型（HCT116，HCT8）细胞系中进行p53免疫沉淀测序。差异富集分析发现，两种细胞系中p53结合的重复序列中卫星重复序列（SAT）和LINE-1差异明显。p53突变型（SW620，DLD1）细胞系均存在DNA结合功能域位点突变，提示p53结合DNA功能的丢失和p53-重复序列互作减少相关。
通过RNA测序和染色质免疫共沉淀测序，研究人员发现LINE-1重复序列亚家族L1PA2在p53野生型和突变型细胞系中差异表达。利用RNA原位杂交技术，他们发现人类卫星II（HSATII）卫星重复序列在p53突变型细胞系中显著高表达。
(C)p53突变型和野生型细胞中p53结合的重复序列差异表达图。LINE，Statellite和ERV是三种主要的重复序列类型；(E) p53突变型和野生型细胞中HSATII RNA原位杂交代表图和统计图。
鉴于临床前研究发现3TC主要作用于p53突变型结直肠癌细胞，研究人员进行了3TC治疗p53突变的转移性结直肠癌II期单臂临床试验（NCT03144804）。试验入组条件包括p53突变的难治性转移性结直肠癌，进展或不耐受5-氟尿嘧啶（5-FU）、奥沙利铂和伊立替康，及抗EGFR治疗（RAS野生型）；年龄≥18周岁，具有组织学或细胞学记录的晚期（转移或不可切除）患者，在至少两种系统治疗方案中无法治愈且疾病进展。
最终共有32名患者被纳入这个研究。首批9名患者以28天为一个周期，每日口服2次3TC，每次150mg。9名受试患者评估安全后，剩下的23名患者将剂量增至每次600mg。每8周进行一次肿瘤评估，直到根据RECIST标准或药物不耐受评估为疾病进展。
从治疗效果来看，疾病稳定（SD）的患者有8名（25%，Pts 7，8，11，15，20，28，31，34），他们的中位无进展生存期为149天。其中患者Pt 20无进展生存期最长，达到230天。
从治疗的安全性来看，无5级不良事件发生，大多数受试患者的不良事件为3级（18/32，56.3%），例如淋巴细胞数量减少（11/32，34.4%）等。不过大部分3级不良事件是肿瘤恶性进展或临床试验前的系统性治疗导致的，3TC治疗相关的3级不良事件极少，包括贫血（1/32，3.1%）和腹泻（2/32，6.3%）等。
(A)临床试验设计；(B) 32名受试患者试验结果统计。
为了探究3TC疗效是否和重复序列表达有关，研究人员评估了受试患者治疗前的样本。
他们对其中30名患者治疗前样本进行RNA-seq，结果表明所有受试患者均高表达多种重复序列RNA，且肿瘤中均存在p53突变。他们用免疫组化技术评估了其中28名患者肿瘤样本的LINE-1蛋白表达情况，发现SD患者LINE-1蛋白水平显著低于PD患者，表明PD患者中LINE-1逆转录酶活性足够克服试验所用剂量的3TC。
由于免疫组化检测的是肿瘤原位LINE-1蛋白，只能反应肿瘤原发灶，而不能反应患者全身的肿瘤负荷变化情况，因此研究人员利用蛋白质超敏检测技术（Simoa）检测到了外周血LINE-1蛋白。
他们发现SD患者相较于PD患者，其血浆LINE-1水平显著降低，这可能提示肿瘤负荷的差异，意味着3TC单药可能无法对抗具有高逆转录酶活力的肿瘤。总的来看，3TC治疗后疾病稳定和LINE-1蛋白基线水平低有关，而和重复序列RNA表达或者体细胞逆转录转座无关。这说明3TC是在重复序列RNA生命周期中逆转座整合至基因组前发挥作用。
(G)免疫组化检测受试患者肿瘤样本中LINE-1蛋白表达水平；(H) 受试患者血清LINE-1蛋白含量。
为了更好地理解3TC对结直肠癌的作用，研究人员利用RNA测序分析了13名受试患者配对的治疗前和治疗中的样本，发现经过治疗肿瘤患者重复序列表达显著降低。GO分析发现干扰素应答基因显著上调。
已有报道干扰素应答可能和感知重复序列的RNA和DNA有关[3]。于是研究人员假设3TC治疗可能改变重复序列cDNA或逆转录形成的RNA:DNA杂交分子含量。他们利用定量免疫荧光检测肿瘤细胞胞浆双链DNA或RNA:DNA杂交分子含量，结果发现3TC处理后的p53突变型（SW620，DLD1）细胞系中双链DNA含量显著降低，而RNA:DNA杂交分子含量显著增加。
(E)和(F)分别是免疫荧光检测3TC或DMSO处理后的p53突变型（SW620，DLD1）结直肠癌细胞胞浆dsDNA含量和RNA:DNA杂交分子含量的代表图和统计图。
已知STING是胞浆DNA和RNA:DNA杂交分子的识别受体，在DLD1细胞系中敲降STING后可部分减弱3TC的抗迁移作用。这些结果说明3TC可能通过调节胞浆核酸分子含量激活STING信号，从而抑制细胞迁移。
既然p53突变使重复序列表达活化，从而使3TC有发挥作用的空间，那么解除对重复序列的沉默促进其表达，能否进一步增强3TC的疗效或应用范围呢？
考虑到DNA甲基化是重复序列表达沉默的原因之一[2]，于是研究人员联合使用DNA去甲基化药物阿扎胞苷(AZA)和核苷类逆转录酶抑制剂，发现二者联用可促进细胞坏死，从而降低肿瘤生长，且在p53野生型和突变型肿瘤中均有作用。
联合用药靶向调控重复序列表达的原理图
那么这种联用效果是否由重复序列介导的呢？研究人员聚焦于前述提到的人类卫星II（HSATII）卫星重复序列，利用反义核酸LNA[5]靶向HSATII，发现p53突变型（SW620，DLD1）细胞系发生坏死，从而导致癌细胞的生长被抑制。这些结果表明重复序列介导的干扰素应答和细胞坏死是这些药物的可能作用机制。
研究人员对3TC的作用机制探究并未止步于此。他们用3TC处理p53突变型细胞系后进行RNA测序分析，结果发现除了前述提到的先天免疫和干扰素应答基因上调外，DNA损伤应答相关基因也显著富集。
在5-氟尿嘧啶/奥沙利铂（5FU/Oxa）联合处理的结直肠癌细胞系和经过放化疗的结直肠癌患者样本中，研究人员发现HSATII卫星重复序列高表达。因此，研究人员尝试3TC联合5FU/Oxa处理肿瘤细胞，结果显示更高的细胞毒性。
火山图显示3TC或DMSO处理后的p53突变型细胞系差异富集基因。DDR：DNA损伤应答相关基因；IFN：干扰素应答相关基因。
总的来说，这个研究表明，结直肠癌会表达丰富的具有类似病毒生命周期的重复序列，常用的抗病毒核苷类逆转录酶抑制剂有望成为肠癌治疗药物。
值得一提的是，3TC治疗p53突变的转移性结直肠癌Ⅱ期单臂临床试验提示3TC治疗可能使部分患者获益，为后续NRITs联合化疗等治疗肠癌奠定了基础。
机制示意图
此外，这项研究也提示我们重复序列等基因组中的“暗物质”，在肿瘤发生进展中的作用有待深入探究，这将有助于我们找到更多的肿瘤靶点和联合治疗策略。
