实验研究：九龙藤黄酮抑制自噬抗心肌缺氧损伤的作用机制

2022年10月11日17:44:49 健康 1525

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）以心肌缺血和缺氧为特征，其发病率和死亡率高，严重危害人类健康[1]。诱发心肌缺血损伤的因素有多种，包括氧化应激、钙超载、炎症反应、凋亡、自噬和坏死等，其中自噬在心肌缺血的发生发展中起重要作用。自噬是长寿蛋白和胞质细胞器降解和再循环的重要过程[2]，在心肌细胞缺血缺氧时抑制自噬有利于心肌细胞的存活，并减轻心肌损伤[3]。

九龙藤黄酮（Bauhinia championii flavones，BCF）是广西民族特色草药九龙藤Bauhinia championii (Benth.) Benth.的主要活性成分，本课题组前期研究表明，BCF具有抗炎、抗氧化的作用，能够通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路，抑制细胞凋亡及过度自噬，抗心肌缺氧损伤[4-6]；细胞实验发现上调miR-384-5p能增强BCF抑制自噬的作用[4]，但在整体动物水平，miR-384-5p对BCF的作用尚不明确。

研究表明，长链非编码RNA（long non coding RNA，LncRNA）能够发挥微小RNA（microRNA，miRNA）海绵作用，竞争性结合miRNA的反应元件，进而对其靶基因进行负向调控[7]。LncRNA心肌梗死相关转录本（myocardial infarction associated transcript，MIAT）参与了心肌梗死、动脉粥样硬化等多种疾病过程[8]，如结合miR-150部分增强心肌肥厚，结合miR-26a抗动脉粥样硬化[9-10]，但LncRNA MIAT参与心肌梗死的分子机制仍有待深入研究。LncRNA MIAT能否通过“分子海绵吸附”作用结合miR-384-5p影响自噬，参与心肌缺血损伤尚无相关报道，其对BCF的心肌保护作用也未阐明。本研究基于LncRNA MIAT/miR-384-5p信号轴探究BCF对心肌缺氧损伤的作用及机制，为临床治疗心肌缺血损伤提供实验依据。

结果

BCF下调LncRNA MIAT并上调miR-384-5p基因表达

如图1所示，与对照组比较，OGD组细胞中LncRNA MIAT基因表达显著上调（P＜0.01），miR-384-5p基因表达显著下调（P＜0.01）；与OGD组比较，BCF组细胞中LncRNA MIAT基因表达显著下调（P＜0.01），miR-384-5p基因表达显著上调（P＜0.05）。

LncRNA MIAT靶向调控miR-384-5p

双荧光素酶报告基因实验结果显示（图2），共转miRNA-384-5p和LncRNA MIAT-WT后荧光素酶活性显著降低（P＜0.001），说明miRNA-384-5p与LncRNA MIAT互作。RAP实验进一步验证两者的作用关系（图2-C），miRNA-384-5p被LncRNA MIAT探针富集，表明LncRNA MIAT与miR-384-5p存在相互作用。如图2-D、E所示，与sh-NC组比较，敲低LncRNA MIAT后LncRNA MIAT基因表达降低（P＜0.001），而miRNA-384-5p基因表达升高（P＜0.05）。上述结果表明miR-384-5p是LncRNA MIAT的靶基因，并受到LncRNA MIAT的负调控。

敲低LncRNA MIAT抑制自噬减轻心肌缺氧损伤

如图3-A、B所示，与对照组比较，OGD组细胞存活率显著降低（P＜0.001），心肌缺血损伤标志物cTn-I水平显著升高（P＜0.001）；敲低LncRNA MIAT能够提高H9c2细胞存活率（P＜0.01），降低cTn-I水平（P＜0.01），提示下调LncRNA MIAT能减轻OGD诱导的心肌缺氧损伤。

进一步验证LncRNA MIAT对OGD诱导的H9c2细胞自噬的影响，如图3-C～E所示，与对照组比较，OGD组自噬小体及自噬溶酶体数量增多（P＜0.01），Beclin1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-I值升高（P＜0.001），p62蛋白表达水平降低（P＜0.001）；与sh-NC组比较，敲低LncRNA MIAT后自噬小体及自噬溶酶体数量减少（P＜0.01），Beclin1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-I值降低（P＜0.01、0.001），p62蛋白表达水平升高（P＜0.001），表明敲低LncRNA MIAT能抑制OGD诱导的心肌细胞自噬。

BCF对OGD诱导的H9c2细胞存活率和上清液中cTn-I水平的影响

如图4所示，与OGD组比较，BCF组细胞存活率显著升高（P＜0.01），上清液中cTn-I水平显著降低（P＜0.001）；敲低LncRNA MIAT可增强BCF的作用（P＜0.01、0.001）。

BCF对OGD诱导的H9c2细胞自噬小体的影响

如图5所示，与OGD组比较，BCF组自噬小体数量显著减少（P＜0.01）；敲低LncRNA MIAT可增强BCF的作用（P＜0.01）。

BCF对OGD诱导的H9c2细胞自噬相关基因及蛋白表达的影响

如图6所示，与OGD组比较，BCF组细胞中Beclin1、Cathepsin D及LC3基因表达水平均显著降低（P＜0.05、0.01），Beclin1和Cathepsin D蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01），LC3-Ⅱ/LC3-I值显著降低（P＜0.01）；敲低LncRNA MIAT可增强BCF对OGD诱导的H9c2细胞自噬的抑制作用（P＜0.05、0.01）。

BCF对OGD诱导的H9c2细胞自噬流的影响

如图7所示，与OGD组比较，BCF组细胞中自噬体和自噬溶酶体数量均显著减少（P＜0.01）；敲低LncRNA MIAT后自噬体和自噬溶酶体数量进一步减少（P＜0.05），表明BCF通过下调LncRNA MIAT抑制自噬体和自噬溶酶体的形成，从而阻滞自噬流。

敲低LncRNA MIAT对大鼠心脏miR-384-5p基因表达的影响

如图8所示，与对照组比较，AMI组大鼠心脏中miR-384-5p基因表达显著下调（P＜0.001）；敲低LncRNA MIAT显著增加心脏中miR-384-5p基因表达（P＜0.05）。

沉默miR-384-5p基因表达逆转BCF的抗心肌缺血损伤作用

如图9所示，与AMI＋BCF组比较，沉默miR-384-5p后给予BCF处理，大鼠心肌梗死面积增加，梗死率显著升高（P＜0.01）；血清中cTn-I水平显著升高（P＜0.01），心脏组织中自噬相关基因及蛋白表达均显著上调（P＜0.01），心肌缺血损伤加重。

讨论

AMI是一种严重的致命性疾病，由冠状动脉阻塞引起的心肌缺血损伤是造成患者死亡的原因之一[13]。目前，临床治疗AMI的主要方法为经皮冠状动脉介入（percutaneous coronary intervention，PCI），PCI能够较快且安全地恢复血流再灌注，但其发病血管仍有急性再闭塞的可能性[14]。一些活血化瘀中药具有防治心血管疾病的作用，深入研究其作用机制，有望为开发防治AMI的药物提供依据。

自噬在AMI中的发生机制、调控因素及药物干预为近年研究热点[2]。自噬是一个动态的过程，包括自噬体形成（一般以Beclin1、LC3II为标志）、自噬体与溶酶体融合（一般以Cathepsin D为标志）和自噬体的降解（一般以p62作为标志）3个连续的步骤。细胞在正常情况下很少发生自噬，而内质网应激、缺血缺氧等常诱导自噬[3]。九龙藤是一种传统的中草药和功能性食品，性平低毒，BCF是其茎提取物的主要活性成分，研究发现BCF可抗氧化、抑制细胞凋亡和自噬、减轻心肌缺血缺氧损伤[5-6]，但其具体的分子机制尚不清楚。本课题组前期研究表明miR-384-5p负调控Beclin1表达抑制自噬，过表达miR-384-5p可增强BCF的心肌保护作用[4]。本研究亦发现ODG诱导的H9c2细胞给予BCF预处理后，miR-384-5p基因表达上调，提示miR-384-5p可能参与了BCF抑制自噬的作用。

以双荧光素酶报告基因实验和RAP实验探析miR-384-5p的上游靶点，结果显示，LncRNA MIAT负靶向调控miR-384-5p。作为AMI的危险等位基因，LncRNA MIAT在AMI患者和小鼠血浆中高表达[15-16]，但LncRNA MIAT在OGD诱导的H9c2细胞中的作用尚未见报道。本研究发现，OGD诱导的H9c2细胞中LncRNA MIAT表达上调，敲低LncRNA MIAT可提高心肌细胞活力、降低cTn-I水平、减少自噬小体和自噬溶酶体数量、降低Beclin1蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-I值、增加p62蛋白表达、抑制心肌缺氧损伤。为进一步验证BCF是否通过影响LncRNA MIAT发挥心肌保护作用，在敲低LncRNA MIAT基因的心肌细胞稳转株中给予BCF预处理，结果显示，与单纯BCF预处理相比，合并敲低LncRNA MIAT后，BCF抑制自噬和减轻心肌缺氧损伤的作用显著增强，说明LncRNA MIAT可能是BCF发挥心肌保护作用的重要靶点。

为进一步验证miR-384-5p对BCF作用的影响，构建AMI动物模型，并通过在体转染方式，沉默大鼠miR-384-5p基因表达。结果显示，沉默miR-384-5p逆转了BCF抑制自噬的作用，加重了大鼠心肌缺血损伤，提示BCF抗心肌缺血损伤作用可能与上调miR-384-5p基因表达有关。

综上所述，本研究发现BCF通过LncRNA MIAT/miR-384-5p抑制自噬减轻心肌缺氧损伤（图10）。由于LncRNA MIAT全长序列为8474 bp，序列太长，过表达后极有可能造成细胞死亡，因此本研究未对过表达LncRNA MIAT情况进行分析。后续将进一步在体内验证BCF下调LncRNA MIAT抑制自噬减轻心肌缺血损伤的作用。