“医疗器械蓝皮书”宏基因组测序技术在病原微生物检测中的应用

【编者按】本文摘选自《中国医疗器械行业发展报告（2021）》B29，作者王佳伟，首都医科大学附属北京同仁医院神经内科主任兼医院中心实验室主任,美国约翰霍普金斯大学博士后, 医学博士,教授, 主任医师, 博士生导师,美国神经科学学会会员；夏涵，予果生物技术（北京）有限公司，法定代表人总经理；马自立，予果生物技术（北京）有限公司，副总经理。

【摘 要】病原微生物检测能够对感染性疾病的病原体或者代谢物进行检测分析，是体外诊断试剂（In Vitro Diagnosis，IVD）的细分领域之一。目前病原微生物诊断技术不断发展，传统病原微生物培养技术主要有分离培养、涂片镜检、生化鉴定、抗原抗体免疫等，面临着阳性率低、诊断周期长，无法达到检测病原体的要求。分子生物学检测方法快速发展，有诸多方法可将少量的核酸分子扩增到易于检测的水平。这些检测方法包括恒温扩增技术(LAMP)、实时荧光定量PCR等。伴随着二代测序等新技术的出现，给临床病原微生物的诊断提供了新的解决方案，特别是普通实验室难以培养、生长缓慢、未知病原体、罕见病原体等具有明显优势。但二代测序方法目前仍然面临若干挑战，如检测成本偏高、对实验环境要求严苛、部分检测结果需人工解读等。分子诊断的新方法和新技术正在改变我们实践临床微生物学的方式，这影响了病原微生物相关检测行业。

【关键词】病原体 核酸 二代测序

【好消息】：《医疗器械蓝皮书》第五部 《中国医疗器械行业发展报告（2021）》出版上市

（以下为正文）

病原微生物检测能够对感染性疾病的病原体或者代谢物进行检测分析，是体外诊断试剂（In Vitro Diagnosis，IVD）的细分领域之一。微生物检测主要是对人类感染性疾病的病原体或病原体的代谢物检测和分析，包括细菌培养、鉴定和药敏结果分析等，目的是为临床治疗提供诊疗依据，从而为患者选择最适合药物及治疗方法。基于核酸扩增的技术可提供灵敏而特异的结果，并具有比以往更短的检测时间。

2019年12月，新冠疫情在武汉爆发，随着新冠疫情的发展和蔓延，2020年新型冠状病毒成为大众耳熟能详的词语。在2020年中，国家食品药品监督管理总局总共审批通过1026个三类注册证，关于病原微生物检测的产品多达111个，其中新型冠状病毒（2019-nCoV）相关产品达到54个。

国家卫健委发布至2021年2月1日每天单管核酸检测能力已经提高到每天1600万份，已经比2020年3月份的126万份/天提高了11倍多。足以说明分子诊断领域正处于飞速发展的黄金期。

一 核酸检测方法在病原微生物领域应用

临床微生物学实验室的基本目标是在临床样本中确定并识别病毒、细菌、真菌或寄生虫这些病原体，并在可能的情况下提供有助于指导临床管理甚至预后的其他信息，例如抗生素敏感性或有无毒力因子。

到目前为止，临床微生物学实验室主要通过基于生长的检测和生化测试来达到这些目标。例如，细菌根据其特有的微观形态、生长所需的营养和催化某些反应的能力，病毒在组织培养中的细胞病变效应以及真菌和寄生虫的显微形态；通过评估抗生素存在情况下微生物的生长情况来确定抗生素敏感性。这些技术可靠但耗时。核酸检测的使用越来越成为临床微生物实验室用于检测、定量和/或鉴定的标准方法，逐渐取代了表型特征鉴别和显微镜镜观察的方法。

临床样本特异性DNA和RNA碱基序列的检测与定量技术已成为临床诊断细菌、病毒、寄生虫和真菌感染的强大工具。核酸检测主要有4个用途。第一，用于定性/定量检测临床样本中的病原体。第二，用于鉴定传统方法难以鉴定的病原体。第三，用于确定同一病原体的两个或更多分离株是否有亲缘性(即是否属于同一“克隆”或“菌株”)。第四，用于预测病原体对药物的敏感性。其中一些已经国家药品监督管理局(NMPA)批准用于临床诊断[[2]]。

有诸多方法可将少量的核酸分子扩增到易于检测的水平。这些检测方法包括恒温扩增技术(LAMP)、实时荧光定量PCR(qPCR)和测序方法。在任何情况下，病原体特异性DNA或RNA序列的指数式扩增都依赖于退火到目标序列的引物。扩增后的核酸可以在反应完成后检测，也可以在扩增过程中(实时检测)检测。核酸扩增检测的灵敏度远远高于培养法、免疫学检测抗体等传统检测方法，且免疫学检测抗体主要用于回顾性诊断。与其他方法相比，病毒培养是一种更耗时的方法。

随着艾滋病相关疾病、巨细胞病毒感染以及乙型和丙型肝炎病毒感染的新治疗方案的出现，在治疗开始后的不同时间需通过确定基因型和病毒载量来监测对治疗的反应。定量核酸扩增方法可用于检测HIV(PCR)、巨细胞病毒(PCR)、乙型肝炎病毒(PCR)和丙型肝炎病毒(PCR和TMA)。许多实验室已经通过核酸扩增方法的分析物专用试剂对这些病原体和其他病原体(如EB病毒)进行了验证和定量分析[[3]]。

目前，国家药品监督管理局批准多种病原体核酸检测试剂盒，包括结核分枝杆菌、淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、B群链球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测。同时，国家药品监督管理局批准的多重核酸检测方法也可用于同时检测一些呼吸道或生殖道病原体（见表1）。同样，许多实验室已经将市售试剂和分析物特定试剂用于诊断性试验。

表1 国家药品监督管理局批准多重呼吸道核酸检测方法汇总

产品名称	方法学	生产企业	样本类型	预期用途
六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片法）	恒温扩增芯片法	成都博奥晶芯生物科技有限公司	咽拭子	新型冠状病毒（2019-nCoV）S和N靶基因以及甲型流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒（2009）、甲型H3N2流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒核酸。
甲型/乙型流感及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒（实时荧光PCR法）Xpert Xpress Flu/RSV Assay	实时荧光PCR法	美国赛沛公司Cepheid	鼻咽拭子	甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）RNA。
13种呼吸道病原体多重检测试剂盒（PCR毛细电泳片段分析法）	PCR毛细电泳片段分析法	宁波海尔施基因科技有限公司	痰液或咽拭子	甲型流感病毒（H7N9、H1N1、H3N2、H5N2）、甲型流感病毒H1N1(2009)、季节性H3N2病毒、乙型流感病毒（Victoria株和Yamagata株）、腺病毒（B组、C组和E组）、博卡病毒、鼻病毒、副流感病毒（1型、2型、3型和4型）、冠状病毒（229E、OC43、NL63和HKU1）、呼吸道合胞病毒（A组和B组）、偏肺病毒、肺炎支原体和衣原体（沙眼衣原体和肺炎衣原体）。其中腺病毒、副流感病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒和衣原体检测结果不分型。
七项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(双扩增法)	双扩增法	武汉中帜生物科技股份有限公司	咽拭子	甲型流感病毒的H1N1/H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒的1/2/3型、腺病毒的B/E属、肺炎支原体、肺炎衣原体的核酸。本产品可区分样本中不同病原体，但无法区分同一病原体的不同型别。
三项呼吸道病毒核酸检测试剂盒（双扩增法）	双扩增法	武汉中帜生物科技股份有限公司	咽拭子	呼吸道合胞病毒、人副流感病毒的1/2/3型、腺病毒的B/E属的核酸。
呼吸道病毒核酸六重联检试剂盒（PCR荧光探针法）	PCR荧光探针法	北京卓诚惠生生物科技股份有限公司	鼻拭子	甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒I型及副流感病毒III型核酸。
六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)	PCR-荧光探针法	圣湘生物科技股份有限公司	有	本试剂盒用于定性检测人咽拭子样本中甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、人鼻病毒和肺炎支原体的核酸。

核酸测试有助于检测和鉴定难生长或不可培养的致病菌，如军团菌、埃立克体、立克次体、巴贝虫、疏螺旋体。此外，国家药监局为应对重大突发公共卫生事件，出台了《医疗器械应急审批程序》，对涉及公共卫生问题的病原体检测产品，如H1N1、埃博拉、新冠病毒等体外诊断试剂实行了快速审批，以新冠病毒检测试剂为例，国家药品监督管理局发布《2020年度医疗器械注册工作报告》显示，2020年国家药监局共批准了54个新冠病毒检测试剂（25个核酸检测试剂，26个抗体检测试剂，3个抗原检测试剂），其中核酸快速检测产品包含8个，形成了全面的新冠检测产品覆盖体系，产能达到2401.8万人份/天，助力疫情防控。

二 新一代宏基因组测序技术的应用

宏基因组测序技术 (metagenomics next-generation sequencing, mNGS) 直接对人体临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与病原体数据库进行逐一比对并分析序列信息，依据大数据分析比对得出的序列信息来判断样本所包含的病原微生物种类，该技术方法能够检测其中的多种病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等）[[4]]。能够推进诊断方法发展和新病原体发现，推动感染病流行病学和病原体研究，为感染控制措施、公共卫生应对疫情和疫苗开发提供素材。

（一）检测周期相对短

临床传统检测方法目前依然是临床一线检测主要手段，但各种方法检测周期不一。有的能够快速得到结果，比如PCR及其衍生技术；但也有很大部分周期较长，像传统培养平均3-5天，结核分支杆菌/非结核分枝杆菌要求培养42天。基于检测方法的技术革新，mNGS 的病原体鉴定作为临床实验室检测近几年的新方法，在重症感染患者的临床检测及诊断中，给患者赢得了治疗时间，减少其他尝试性药物的使用，综合治疗费用可能更低。mNGS测序对比可一次性测定几百万甚至上亿条DNA或者RNA序列，极大的提高了全基因组测序效率，压缩了检测周期。

（二）阳性检出率高

传统的临床检测方法，对涵盖细菌、真菌、病毒等的病原体，病原体诊断的金标准仍是培养结果为阳性，但实际检测中绝大多数病原体不可培养，无法得出培养结果。关于mNGS应用于感染性疾病诊治的研究，发现 mNGS 敏感性高于传统培养，在结核/真菌/病毒和厌氧菌诊断方面优势更明显，比如一些常见方法不易检测到的病原微生物，像努卡菌、病毒、无法培养的非典型病原和抗生素使用后无法生长的细菌。有文献报道NGS为基础的宏基因组测序在脓肿性病变病原检测作用突出，阳性率高[[5]]。同样具有较高的灵敏度和特异性的PCR检测，其无法完成同时一次性多种病原体筛查，故检出效率不高[[6]]。

（三）一次检测覆盖率广

常规的临床病原学诊断往往只能针对几种目标病原体进行检测，不能有效检出临床样本中所有的病原体微生物，比如质谱方法在细菌检测方面数量有限；免疫学方法操作简单，但由于临床样本中病原体种类繁多，不能做到同时检测多种抗原、抗体检测。新一代的基因芯片技术仅能定向性筛查知的病原体基因组，对新的未知病原体无法检测[[7]]。在临床上超过 2/3 的感染性疾病因最终无法鉴定所感染的病原体，导致无法针对性地用药，且临床医生对目标病原体的判断水平参差不齐，经验试错情况时有发生[[8]]。

mNGS能在较短的时间内完成对样本的无靶向检测，单次即可检测上千种病原体[[9]]。

（四）可以识别预期外和罕见的病原微生物

未知或变异病原体难以鉴定准确性，当前对未知病原体的鉴定，主要围绕着病毒抗原检测、核酸检测和病毒分离培养三种检测，病毒分离培养技术存在着缺陷，导致对未知病原体分析的准确性存在着一定的不足；而PCR检测方法要求检测病原体的序列必须已知。

近年来出现的新发病原体感染SARS病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒等不断涌现，传统的检测方法都无法对未知的病原体进行鉴定，mNGS可以在完全没有先验信息或者临床倾向性的时候检测到病原，对少见、罕见或者新发感染性病原体的鉴定、检出方面具有绝对的优势。

2017年，复旦大学华山医院感染科张文宏教授团队，应用NGS技术在1例眼内炎患者的玻璃体液中检测到伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV )，首次证实PRV可以感染人类，并引起眼内炎[[10]]。2016年利用NGS发现全球首例嗜冷杆菌相关脑膜炎[[11]]。

2015年在3例脑炎死亡患者标本中利用mNGS检测到1种新型博尔纳病毒，来源于斑驳松鼠的新型博尔纳病毒经证实是一种人畜共患病的病原，可以导致人类严重的致死性神经系统感染。对于并非临床常见而没有在多数医院常规开展检测的囊虫、布氏杆菌、螺旋体等病原体，或者培养方法较复杂或非常规开展的李斯特菌、奴卡菌等病原体，mNGS检测可以规避常规检查的不足[[12]]。以上这些都体现了mNGS在识别预期外和罕见的病原微生物方面的优势。

（五）抗药性、毒力、病毒分子分型

流行性的感染性疾病如：HIV、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、沙眼支原体等，一般均会具有较强的耐药性，通过对耐药性进行研究可以据此来选择更加具有针对性的药物对患者进行治疗。高覆盖度的mNGS可以获取耐药突变信息，评估病原体的药敏性，有利于精确指导临床用药。

毒力分析在感染性疾病的预防中占据着极为重要的地位，根据毒力可以对该感染性疾病的严重程度、转归进行评估。在mNGS测序中，目前主要是对高毒力细菌进行表征[[13]]。

（六）排除感染

阴性结果有助于临床增强中枢神经系统非感染性病因的证据。对于某个临床样本，mNGS 和mtNGS都为阴性的情况下，且内参检测值提示该样本中单位体积内（通常为 1 mL）已知最小病毒小于10个分子时，可以考虑阴性价值，即患者不存在感染性疾病，可能存在免疫性疾病和肿瘤等[[14]]。

2016年神经科领域的“感染性脑（膜）炎病因分型研究”是在国家科技部和卫计委领导下的第一批精准医学十三五国家重点专项，空军军医大学西京医院赵钢教授团队联合首都医科大学附属北京同仁医院王佳伟教授团队、河北医科大学第二医院卜晖教授团队以及予果生物的重点专项研究，再次展现了mNGS的优势：无需先验性假设，改变传统先猜再测的模式，克服了传统靶向诊断的局限性；敏感性和特异性均高于传统方法；可以检测罕见病原和特殊病原；一次检测，全面覆盖，检测范围更广、时间更短、效率更高[[15]]。

（七）mNGS面临的挑战

mNGS方法在病原感染方面的临床应用方面，中国比美国走的更加靠前。但该方法仍然面临若干挑战，体现在检测成本偏高等、对实验环境要求严苛、部分检测结果需人工解读。

1 目前多数测序厂商提供的mNGS检测服务，测序的数据量高达几十兆，使得测序成本居高不下。如何在不影响准确度的前提下，减少mNGS的数据量，降低测序成本，达到如NIPT（“无创产前染色体非整倍体”）这种成熟NGS产品的标准，是对mNGS技术和应用的挑战，但也会是行业发展趋势。

2 由于环境中存在各种大量的微生物，从实验室的空气、生物试剂、耗材等都有可能检测出微生物的核酸片段，因此不同于肿瘤、无创产前等NGS应用领域，病原微生物测测序需要有更高洁净度的实验室环境，避免背景和污染病原体对结果的干扰。

3 人体样本，尤其是开放腔体的样本，如肺泡灌洗液、痰液等里面存在大量各种微生物，在NGS测序过程中不可避免的被检测出来，因此如何解读检出各类微生物，并且判别哪些是致病病原体，对临床来说仍然是一个挑战。

总体来说，mNGS在感染性疾病的病原学筛查方面具有诸多优势，对于一些进展快、起病急的感染疾病来说能够在短时间内明确致病原微生物，快速为临床诊断提供依据。与一些传统方法如培养相比，阳性率高，当然阴性结果也具有排除感染的作用。并且能够识别预期外和罕见的病原微生物，随着数据量的增加及技术的发展，甚至能够检测耐药性，分析毒力和病毒分子分型。

目前的mNGS经济成本较高，短期内尚不太可能成为临床一线检测手段，但对不明原因发热、初次抗菌治疗无效、免疫缺陷等特殊人群中仍是一种有效的广谱病原体筛查方法。此外，mNGS与传统的分子、血清学检测等方法在感染诊断的检测中联合使用可发挥关键作用[[16]]。

三 未来发展趋势和展望

正如显微镜使微生物可见而打开了微生物学世界的大门，当今基因组学的技术进步为微生物学家提供了强有力的新方法，能以前所未有的分辨率表征所有微生物背后的遗传图谱，从而阐明它们彼此之间、它们与环境以及人类健康之间的复杂和动态的相互作用。

感染病基因组学领域包含了广阔的、研究活跃的前沿领域，有可能改变与感染病相关的临床实践。虽然遗传学在阐明感染过程和管理临床感染病方面一直发挥着关键作用，但基因组学将我们的思维和方法从单基因研究扩展到整个基因组序列、结构和功能，正在发现研究的新的可能性及改变临床实践的机会。

既有以前所未有的敏感性、特异性和速度的研发诊断方法，又有设计新颖的公共卫生干预措施，基因组学的技术和统计创新正在重塑我们对微生物世界对人类健康影响的认识。

参考文献

[[2]]DennisL. Kasper, Anthony S. Fauci,哈里森感染病学[M],上海科学技术出版社,2019.

[[3]]GaryW. Procop.Molecular Diagnostics for the Detection and Characterization ofMicrobial Pathogens[J].Clinical Infectious Diseases 2007; 45:S99–111.

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[[6]]冯国栋,贺曼, 汪昕.二代测序技术在诊断神经系统感染性疾病中的应用[J].诊断学理论与实践,2018(17)4:391-395

[[7]]王升启.分子诊断技术在传染病病原体检测中的应用 [J].传染病信息,2014,27(5):266-269

[[8]]李颖,宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识（第一版）[J].中华急诊医学杂志,2020,32(5):531-532.

[[9]]Lloyd-Price J, Abu-Ali G, Huttenhower C. Thehealthy human microbiome [J]. Genome Med, 2016, 8 (1): 51. DOI:10.1186/s13073-016-0307-y.

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[[11]]Ortiz-Alcántara JM,Segura-Candelas JM,Garcés-AyalaF,et al.Fatal Psychrobacter sp. Infection in a pediatric patient withmeningitis identified by matagenomic next-generation sequencing incerebrospinal fluid[J].ArchMicrobiol,2016,198(2):129-135.DOI:10.1007/s00203-01501168-2.

[[12]]Mongkolrattanothai K,Naccache SN,Bender JM,etal.Neurobrucellosis:Unexpected Answer From Metagenomic Next-GenerationSequencing[J].J Pediatric Infect DisSoc,2017,6(4):393-398．

[[13]]权敏,张中伟,苟雪静,等. 宏基因组测序在临床重症感染患者寻找病原体中的应用[J]. 四川大学学报(医学版),2019(03):425-428.

[[14]]Feng Y,Ramnarine VR, Bell R, et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis ofhuman prostate microbiota from patients with prostate cancer [J]. BMC Genomics,2019, 20 (1): 146.DOI: 10.1186/s12864-019-5457-z.

[[15]]张赟,石晓丹,杜芳,赵钢.宏基因组二代测序技术在中枢神经系统感染性疾病病原诊断中的应用及发展[J].中国临床神经科学,2020,28(3):328-333.

[[16]]Wang Z,Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics [J].Nat Rev Genet, 2009, 10 (1): 57-63. DOI:10.1038/nrg2484.

（完）