引言
胞嘧啶鹼基編輯器(CBEs)是引入C-T鹼基轉換的有效工具，但其臨床應用受到脫靶效應和旁觀者效應的限制。
2024年3月29日，華東師範大學李大力、王立人及上海交通大學曾凡一共同通訊在Nature Chemical Biology 在線發表題為「Engineering APOBEC3A deaminase for highly accurate and efficient base editing」的研究論文，該研究開發了一種工程APOBEC3A脫氨酶，用於高精度和高效的鹼基編輯。通過人類APOBEC3A (A3A)脫氨酶的結構引導工程，該研究開發了高度精確的A3A-CBE (haA3A-CBE)變體，該變體有效地產生C-to-T轉換，具有狹窄的編輯窗口和接近背景水平的DNA和RNA脫靶活性，而不考慮甲基化狀態和序列背景。
工程脫氨酶結構域與PAM鬆弛的SpCas9-NG變體兼容，通過單導RNAs的靈活定位，能夠精確校正同聚胞嘧啶位點的致病突變。雙腺相關病毒將一種haA3A-CBE變體遞送到酪氨酸血症小鼠模型中，在肝組織中誘導高達58.1%的編輯，並伴有最少的旁觀者編輯，通過單劑量的脂質納米顆粒信使RNA遞送haA3A-CBE進一步降低了這一水平。這些結果凸顯了haA3A-CBEs在精確基因組編輯治療人類疾病方面的巨大前景。
鹼基編輯是一項革命性的技術，它能夠在分裂和非分裂細胞中有效地將一個鹼基對轉化為另一個鹼基對，而不需要雙鏈DNA斷裂或供體模板。有兩種主要類型的鹼基編輯器：腺嘌呤鹼基編輯器(ABEs)和胞嘧啶鹼基編輯器(CBEs)，它們分別誘導高效率的A-to-G和C-to-T轉換。ABEs通常催化鹼基轉化，產物純度非常高(>99.9%)，而CBEs通過胞嘧啶脫胺作用產生尿嘧啶，從而刺激尿嘧啶DNA糖基化酶產生基位，激活細胞鹼基切除修復途徑，將胞嘧啶轉化為胸腺嘧啶和其他核苷酸。
為了提高CBEs的產品純度，使用尿嘧啶糖基化酶抑製劑(UGI)與nCas9和各種胞苷脫氨酶結構域融合，開發出具有高C•G-to-T•A產品純度的CBEs。此外，一些研究小組還開發了C-to-G鹼基編輯器，利用尿嘧啶DNA糖基化酶替代CBE中的UGI，或僅在CBE結構中使用進化的胞苷脫氨酶變體，有效地生成C•G-to-G•C轉換。這些鹼基編輯器已廣泛應用於動物基因工程、植物基因工程，並在基因治療中顯示出良好的潛力。然而，一些研究報道了CBEs的脫氨酶結構域誘導Cas9非依賴性DNA和RNA脫靶突變，這可能會阻礙CBEs在精確編輯方面的廣泛應用，特別是在臨床環境中。此外，由目標位點上不希望的鹼基轉換引起的旁觀者效應也可能對精確編輯構成挑戰。
已經實施了幾種策略來提高鹼基編輯器的準確性，包括縮小編輯窗口或募集具有定義序列上下文的脫氨酶變體。截斷脫氨酶CDA1或縮短nCas9與脫氨酶結構域之間的連接可以適度縮小編輯窗口。此外，一些在特定序列背景下優先脫氨胞嘧啶的脫氨酶的工程設計導致了eA3A-CBE和A3G-CBE的發展，它們分別催化TC和CC基序中的C-to-T轉化。特別是對於eA3A-CBE，由於限制基序偏好，旁觀者編輯量大大減少，效率高，脫靶效應最小。rAPOBEC1脫氨酶的蛋白質工程已經產生了CBE變體，如YE1，FE1和R33A，這些變體顯示出狹窄的編輯窗口和顯著減少脫靶效應。變形式鹼基編輯器具有最小的脫氨酶誘導的脫靶效應，但該系統應用複雜，旁觀者編輯效果仍未得到改善。
A3A的進一步工程開發haA3A-CBE（Credit: Nature Chemical Biology）
該研究在細胞系和人類疾病動物模型中證明了haA3A-CBEs在糾正各種序列背景下的致病性 SNVs方面的顯著效率和精確性。使用PAM鬆弛的SpCas9-NG結合靈活的sgRNA設計進一步提高了haA3A-CBEs校正人類致病性 SNVs的準確性。值得注意的是，大量與疾病相關的T-to-C突變存在於CpG二核苷酸中，CpG二核苷酸通常被甲基化，或者存在於GC基序中。haa3a -CBE特別適合於糾正這些類型的突變，使它們成為治療人類疾病的有希望的候選者，並將CBE工具箱擴展到各種應用中。
華東師範大學生命科學學院博士後楊磊，博士研究生霍雅楠，碩士研究生王嫚（現為東南大學博士研究生）以及博士後張丹為該論文的共同第一作者，華東師範大學為第一單位，華東師範大學李大力研究員，王立人副研究員和上海交通大學基礎醫學院曾凡一為本文通訊作者。華東師範大學生命科學學院劉明耀教授，宋高潔研究員、程義雲教授、呂佳研究員、關玉婷研究員、北京大學伊成器教授及香港中文大學馮波教授等對本項研究提供了重要支持。
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https://www.nature.com/articles/s41589-024-01595-4
責編|探索君
排版|探索君
文章來源|「iNature」
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