撰文丨蕭平
顧名思義，細胞外遊離DNA (cell-free DNA, cfDNA) 由細胞外DNA片段組成，可以通過血漿或血清獲得。在健康個體中，其主要來自血細胞的死亡。在不同的生理和病理狀態下，cfDNA能夠發生改變。例如，在癌症患者中，一部分cfDNA來自於腫瘤細胞，對這部分被稱為循環腫瘤DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) 的DNA進行序列分析，能夠揭示腫瘤特異性的基因改變。基於cfDNA分析的液體活檢 (liquid biopsy) 為無創性診斷提供了新的策略【1-3】。
在血漿中，cfDNA主要以核小體 (cf核小體) 的形式存在。核小體是染色體的基本組成單元，其由~150 bp的DNA包裹組蛋白八聚體形成，在DNA序列信息之外，組蛋白不同化學修飾的組合賦予了核小體組織特異性的表觀遺傳信息，並提供了細胞內基因表達和調控的狀態。證據表明，cf核小體上保留了部分表觀遺傳信息，通過ChIP-seq，其上的表觀信息可以被解讀【4】。
雖然目前的方法就能夠讓我們獲得血漿中cf核小體的表觀遺傳信息，但它們有很大的局限性。主要來說，相關檢測的樣本需求量大、檢測範圍有限、成本較高，同時，獲得的信息有限，且解析度較差，例如，通常只能得到單一的觀測信息 (例如單一的修飾分布，或者核小體佔位情況)。因此，高解析度的、整合不同層面信息的檢測方法是亟需建立的。
近日，以色列魏茨曼科學研究所Efrat Shema課題組在Nature Biotechnology發表題為Multiplexed, single-molecule, epigenetic analysis of plasma-isolated nucleosomes for cancer diagnostics的研究論文，開發了一種基於單分子成像的液體活檢方法——EPINUC，該技術能夠從少於1 mL的血漿樣本中分析多個表觀遺傳信息參數。進一步地，研究人員利用該檢測方法，結合蛋白質生物標誌物的高靈敏度檢測，證明了其在結直腸癌診斷中的重要價值。
首先，基於前期建立的利用全內反射顯微鏡成像技術 (Total internal reflection microscopy. TIRF) 觀測組蛋白修飾組合的單分子成像體系【5】，研究人員開發了EPINUC (Epigenetics of plasma-isolated nucleosomes) 技術 (見圖1，具體流程參見圖注)。
圖1 技術路線圖。a. cf核小體的樣品製備過程。這一過程包含兩個酶促反應，分別是通過Klenow聚合酶修復DNA末端，以及通過末端轉移酶添加poly(A)尾。這一過程中使用dATPs和熒游標記的dATPs (Cy3-dATP) 的混合物，用於標記核小體。b. cf核小體通過dA:dT雜交被固定在PEGylated-poly(T) 表面，繼而與靶向不同組蛋白修飾的熒游標記抗體孵育，進行修飾的標記。c. 利用TIRF顯微鏡記錄核小體位置，生成抗體結合事件的延時成像。
研究人員對抗體的特異性以及結合線性進行了檢驗，最終確認了6支抗體適用於EPINUC體系，分別是表徵轉錄激活狀態的H3K4me3、H3K36me3和H3K9ac，表徵轉錄抑制以及異染色質狀態的H3K9me3和H3K27me3，以及表徵增強子的H3K4me1。實驗過程中，核小體被Cy3 (綠色) 標記，兩種組蛋白修飾的組合能分別被AF488 (藍綠色) 和 AF647 (紅色) 標記。在同一觀測體系下，具有特定組蛋白修飾核小體的比例、核小體上不同組蛋白修飾的佔比差異以及不同的組蛋白修飾在同一個核小體上的共同標記情況能夠被記錄和分析 。通過對同一樣品的多次檢測，這一方法的重複性/穩定性也得到了驗證。EPINUC是首個利用小體積樣本 (<1 mL) 進行單分子精度核小體修飾特徵檢測的技術。
在此基礎上，為了獲取更多的評估參量，研究人員利用單分子系統，增加了對蛋白質生物標誌物和DNA甲基化水平的評估和量化 (見圖2) 。
圖2 技術路線圖。a. 蛋白標誌物檢測。首先將靶向不同蛋白的生物素化的抗體錨定在PEG–鏈霉親和素表面，繼而通過孵育，捕獲血漿中的相應蛋白，最後利用熒游標記抗體和TIRF成像進行檢測。這一方案可完成3種蛋白質的同時檢測。b. DNA甲基化檢測。首先對生物素化的MBD2和Cy3標記的cfDNA進行孵育，前者能夠特異性結合於攜帶有甲基化修飾的後者，繼而通過同PEG–鏈霉親和素孵育，生物素-MBD2-甲基化的cfDNA被錨定在PEG–鏈霉親和素表面，進而進行TIRF成像。每個成像點代表一個單一的結合複合體，點的數量對應血漿中DNA甲基化的水平。
建立了以上的檢測平台，研究人員應用EPINUC，從來自33個健康個體和40個晚期CRC患者 (術前或進行手術切除和化療後) 的血漿樣本中，獲得了三個層面——組蛋白修飾、DNA甲基化以及蛋白質生物標誌物——的診斷信息。癌胚抗原 (CEA) 在CRC患者血漿中水平升高，是臨床上經典的生物標誌物【6】。通過單分子成像計數，CRC個體中CEA水平較高，手術切除後患者CEA水平有所降低。但值得注意的是，在少數健康個體中也觀察到較高水平的CEA 。同時探測MST1，進行CEA/MST1比值測定，能夠更好地對樣本進行診斷，展現了組合生物標誌物檢測的優勢所在。另外，手術切除後患者血漿CEA/MST1比值與未切除的CRC患者相比有所改變，且與健康人血漿具有更高的相似性，說明這一檢測在監測治療預後方面的潛在價值。
EPINUC還提供了包括cf核小體總數、6個組蛋白修飾及它們的成對組合在每個血漿樣本的比值的定量測量。與相關報道相一致，CRC患者的血漿cf核小體高於健康對照組。可以看到，雖然大多數表觀遺傳修飾及其參數沒有變化，但有幾個參數存在顯著差異：CRC患者H3K27me3、H3K9me3、H3K9ac和H3K4me1修飾的核小體水平較高；H3K9ac/H3K4me1的比值較高 。值得注意的是，在CRC中，H3K9me3和H3K36me3共同修飾的核小體比例減少，伴隨著以H3K4me3和H3K27me3為標誌的「二價 (bivalent』)」核小體比例的增加，這一結果同經典的認知不謀而合。此外，CRC樣本中DNA甲基化水平降低，與之前的研究也是一致的 。
晚期CRC表觀遺傳和生物標誌物的改變促使研究人員將關注點放在EPINUC是否適用於早期CRC (I、II期)的診斷，利用17個血漿樣本，他們發現，與晚期CRC一樣，早期患者與健康個體之間DNA甲基化水平、CEA、CEA/MST1比值差異性顯著 。值得注意的是，I期、II期CRC患者血漿中H3K27me3和H3K9me3修飾的核小體水平升高，和晚期CRC中的觀察相同 。另外，我們沒有在早期CRC中觀察到cf核小體水平的升高，這可能與腫瘤負荷較低有關。雖然H3K4me1和H3K9ac修飾的核小體的水平與健康組無顯著差異，但早期CRC患者H3K4me1和H3K9ac共同修飾的核小體比例低於健康個體。以上結果表明，CRC早期患者的cf核小體已經發生了各種表觀遺傳信息的改變。進一步地，對胰腺導管腺癌患者血漿樣品的檢測、分析證明，EPINUC以其多層次、多維度信息獲取的優勢能夠助力多種癌症的診斷。
為了對上述結果進行可視化呈現，研究人員進行了主成分分析 (PCA)。PCA顯示出了各組之間的空間距離，其中，早期CRC患者樣本位於健康個體和晚期CRC患者樣本之間，可能反映了一種過渡關係 。緊接著，研究人員利用機器學習，最佳的預測模型呈現出優於單純依賴蛋白質生物標記物、生物標誌物組合DNA甲基化抑或生物標誌物組合組蛋白修飾的診斷性能 ，其靈敏度為92% (95% CI為89.3-94.7)，特異性為85% (95% CI為80.2-89.8)，精確度為92% (95% CI為89.7-94.3)。
圖3 技術路線圖。組蛋白信息的獲得如前文所述，簡言之，即通過dA:dT雜交對cf核小體進行錨定，繼而通過攜帶有熒游標記的組蛋白特定修飾抗體進行孵育、成像。緊接著，通過增加鹽濃度，去除掉組蛋白，原位暴露完整DNA，再進行依賴TIRF成像的單分子測序過程，獲得DNA序列信息。
最後，研究人員結合單分子DNA測序技術，開發了EPINUC–seq技術 (見圖3)，利用不同組織表觀遺傳修飾的不同，探討了通過檢測、確認cf核小體的起源組織，判斷腫瘤始發位置的可能。
這一工作開發了EPINUC單分子檢測技術，將其應用於液體活檢，以單分子精度對多層次的診斷信息，包括組蛋白和DNA修飾以及蛋白質生物標誌物，進行檢測，可以高度特異和敏感地區分CRC患者和健康人群。顯見地，這一技術極大地拓寬了液體活檢領域，並具有應用於腫瘤早期診斷和預後監測的潛力。
原文鏈接:
https://www.nature.com/articles/s41587-022-01447-3
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參考文獻
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4. Sadeh, R. et al. ChIP–seq of plasma cell-free nucleosomes identifies gene expression programs of the cells of origin. Nat. Biotechnol. 39, 586–598 (2021).
5. Shema, E. et al. Single-molecule decoding of combinatorially modified nucleosomes. Science 352, 717–721 (2016).
6. Tiernan, J. P. et al. Carcinoembryonic antigen is the preferred biomarker for in vivo colorectal cancer targeting. Br. J. Cancer 108, 662–667 (2013).
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