苏糖核酸（TNA）是一种非天然核酸，结构简单（图1），能像RNA一样碱基配对，也能折叠形成功能性结构，因此被视作生命起源早期可能的遗传物质。而且，TNA具有优异的抗核酸酶降解能力，在生物医学应用中展现出潜力。
图1. TNA与RNA的化学结构。
能够催化RNA发生化学反应的TNA酶（TNAzyme），不仅在探索RNA世界方面具有重要意义，还可作为高生物稳定性的分子工具应用于研究和治疗。此前，研究者已开发了能切割RNA的TNA酶，实现了细胞选择性的基因沉默（Nat. Chem. 2022, 14, 350）。然而，TNA酶能否催化RNA天然连接反应（即形成3′-5′磷酸二酯键）仍未知。拥有这种活性的TNA酶，可能在早期地球环境中功能性RNA的组装过程中扮演了重要角色，同时也为长片段RNA的体外合成提供了新的生物技术工具。近日，南京大学于涵洋课题组报道了一种能催化天然RNA连接反应的TNA酶。该TNA酶依赖锌离子，12小时反应产率可接近90%，催化核心包含29个碱基，能够加速功能性RNA的生成。相较于其他人工核酶，TNAzyme 24-1兼具优异的生物稳定性和更高的催化速率。这项工作为TNA作为原始酶分子提供了实验证据，并为功能性RNA的合成提供了新工具。相关论文发表于J. Am. Chem. Soc.。
在RNA的末端羟基与5'三磷酸发生连接反应时，既有可能形成非天然的2'-5'磷酸酯键，也有可能形成天然的3'-5'连接方式（图2）。前人研究显示，金属离子显著影响RNA连接反应的活性和选择性。在该体外筛选实验中，锌离子被选作为TNA酶的辅因子，希望能够促进3'-5'磷酸酯键的形成，富集催化RNA天然连接反应的TNA酶。
图2. 催化RNA连接反应的TNA酶的体外筛选。
筛选获得的TNA酶24-1能够催化RNA的天然连接反应，形成新的3'-5'磷酸酯键。TNA酶的催化核心包含29个碱基，删去催化核心后，仅互补的TNA链不能加速RNA底物的快速连接。在相同反应条件下，TNA酶24-1产生的连接产物明显多于DNA酶7DE5（图3）。若将TNA酶的序列以DNA或RNA的形式合成，所得分子不能催化连接反应。
图3. TNA酶更高效催化RNA连接反应。
仅在锌离子存在时，TNA酶能够加速RNA连接反应，其他金属离子（如镁离子、锰离子和钙离子）不能支持TNA酶的催化活性。TNA酶24-1的最适工作温度是23°C，最适工作pH是7.3，最适锌离子浓度是1 mM。TNA酶能够接纳的最短RNA底物片段长度分别是11和7个碱基，对连接位点的碱基要求为D|G，其中D = A, G or U（图4）。
图4. TNA酶催化形成3'-5'磷酸酯键。
TNA酶24-1可用于功能性RNA的组装。若将核酶L1分割为两个片段，在组装之前，这两个片段只展现出微弱的催化活性。而在TNA酶催化的连接反应后，两个RNA片段被连接成一条全长的RNA分子，显示出完整核酶的催化活性（图5）。
图5. TNA酶催化产生功能性RNA。
总结
这项工作报道了催化RNA天然连接反应的TNA酶，该酶能高效连接RNA片段，组装出功能性核酶，为生命起源中TNA的催化潜能提供了直接证据，同时也为RNA操控提供了新型稳定工具。
这项工作的第一作者是博士生王娟，通讯作者是于涵洋教授。陈加余教授、韩峰、邹烨、王梦琪、王瑶对该工作亦有贡献。
A Threose Nucleic Acid (TNA) Enzyme Catalyzing Native 3’-5’ Ligation of RNA
Juan Wang, Feng Han, Ye Zou, Mengqi Wang, Yao Wang, Jia-Yu Chen, Hanyang Yu*
J. Am. Chem. Soc. 2025, DOI: 10.1021/jacs.5c07235
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