引言
在细胞中成千上万的RNA分子是如何准确无误地抵达各自的目的地，从而指导蛋白质的合成，调控复杂的生命活动？从疾病的发生发展到神经元的精细分化，RNA的“空间定位”（RNA localization）扮演着举足轻重的角色。然而，长期以来，一个核心挑战始终困扰着研究人员：我们如何才能在活细胞中，精准地“指挥”这些内源性RNA，去探究它们独特的空间排布究竟如何塑造生命？
传统的研究手段，往往需要对基因组进行繁琐的工程改造，耗时耗力，且效果有限，尤其在高度复杂的原代神经元中更是难上加难。这使得对细胞内“空间转录组”（spatial transcriptome）功能意义的探索，长期处于停滞状态，如同拥有一张细胞的“地图”，却缺乏探索地图上“未知领域”的工具。
5月21日 《Nature》 的研究报道“Programmable control of spatial transcriptome in live cells and neurons”，研究人员开发出一种名为CRISPR介导的转录组空间组织（CRISPR-TO，CRISPR-mediated transcriptome organization）的创新技术，如同为RNA量身打造了一部“时空穿梭机”。CRISPR-TO巧妙地利用了核酸酶失活的Cas13（nuclease-dead dCas13）——这位“RNA导航员”，通过可编程的引导RNA（guide RNA, gRNA），结合化学诱导的“开关”系统，实现了对细胞内源性RNA定位的精准、可逆控制。
这项技术不仅能将RNA精准“投递”到线粒体外膜、P-小体、应激颗粒等各种亚细胞区室，更能实现沿微管的双向主动运输，让我们能实时观测并操控RNA的“细胞之旅”。尤其在高度极化的原代神经元中，CRISPR-TO展现了前所未有的威力，它能够将特定的mRNA（如β-肌动蛋白mRNA）运输到轴突末梢，不仅促进了动态丝状伪足的形成，还出人意料地影响了轴突再生。除此之外，CRISPR-TO还能进行高通量功能筛选，首次识别出像Stmn2 mRNA这类对神经元生长具有驱动作用的关键分子。CRISPR-TO的问世，无疑为空间转录组学领域架起了一座桥梁，填补了现有成像和测序技术的空白，为我们大规模、高通量地探究RNA在生命活动和疾病发生中的神秘功能，打开了全新的视野。
CRISPR-TO：给RNA装上“时空穿梭机”的秘密武器
传统的RNA定位研究方法，往往需要繁琐的基因工程来删除或修改RNA上的特定调控元件，这不仅效率低下，而且这些元件大多是未知的，还可能影响RNA的稳定性和翻译。而CRISPR-TO则另辟蹊径，它利用了核酸酶失活的Cas13（nuclease-dead dCas13）——一种RNA引导的、具备高效特异性RNA结合能力的工具，但它不会切割RNA。
dCas13就像一个聪明的“快递小哥”，而引导RNA（guide RNA, gRNA）则是它手中的“地址条”。CRISPR-TO系统的核心，就是巧妙地将这个“快递小哥”与特定的“定位信号”（subcellular localization signal）或“分子马达蛋白”（motor proteins）连接起来。为了实现精准控制，研究人员还引入了一种化学诱导的二聚化（chemical-inducible dimerization）系统，以植物激素脱落酸（ABA）作为“开关”。脱落酸在哺乳动物细胞中具有良好的正交性，并且能够穿透血脑屏障，是理想的诱导剂。
当脱落酸被添加时，它会促使dCas13与“定位信号”或“分子马达蛋白”结合，从而将dCas13以及它所结合的目标RNA一同引导到预设的亚细胞区室。这项技术支持两种模式的RNA定位：被动扩散和停靠（passive diffusion and docking），以及主动运输（active transport）。
初露锋芒：将RNA精准“投递”到线粒体外膜
CRISPR-TO的首次亮相，是将报告mRNA（reporter mRNA）精确地定位到细胞的线粒体外膜（outer mitochondrial membrane, OMM）上。研究人员设计了靶向GCN4元件的gRNA，并观察到惊人的效果：在ABA处理下，高达74.5%的报告mRNA被成功定位到OMM上，而对照组（DMSO处理或非靶向gRNA）的比例则仅为12.7%和13.9%。表明，CRISPR-TO介导的RNA招募是可诱导且依赖gRNA的。
不仅如此，CRISPR-TO还能精准调控内源性RNA。研究人员将甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）mRNA——一种参与糖酵解和RNA调控的关键基因——定位到OMM。单分子RNA FISH（single-molecule RNA FISH）技术证实了定位的特异性。同样，在靶向gRNA（gT）和ABA处理下，74.5%的GAPDH mRNA成功定位到OMM，远高于对照组的12.7%和13.9%。这展现了CRISPR-TO对内源性RNA的强大操控能力。
该系统还成功将包括β-肌动蛋白（ACTB）mRNA和线粒体氧化磷酸化亚基编码mRNA（SDHC、SDHD和NDUFS2）在内的多种内源性mRNA定位到OMM，即使它们表达水平不同，效果依然显著。此外，CRISPR-TO在不同细胞类型和物种中都表现出良好的通用性，包括人HeLa细胞、人HEK293T细胞和小鼠Neuro-2a神经母细胞瘤细胞。在稳定表达CRISPR-TO组分的HeLa细胞中，OMM定位的GAPDH mRNA比例从0%显著提高到65%，这进一步证明了其在不同传递方法下的灵活性。
在测试不同的Cas13系统时，研究发现dPspCas13b展现出最高的RNA重定位效率，而dRfxCas13d和dLwaCas13a则效果不佳。这提示dCas蛋白的内在特性对CRISPR-TO的效率有显著影响，为未来的优化提供了方向。
揭秘CRISPR-TO的“高效秘籍”：探寻RNA定位的决定因素
CRISPR-TO的高效并非偶然，研究人员深入探究了影响其性能的关键因素：
mRNA表达水平：研究发现，虽然OMM上dCas13的定位水平在不同mRNA表达水平下保持相对稳定，但OMM上定位的mRNA百分比却与表达水平呈负相关（Spearman相关系数r = -0.73）。这意味着CRISPR-TO在定位中低表达水平的mRNA时效果更佳，但在高表达水平（例如每细胞约1.2 × 10^5个mRNA颗粒）下，仍然能够检测到显著的OMM富集。
dCas13结合位点数量：为了确定有效RNA定位所需的最小dCas13结合位点数量，研究测试了不同GCN4重复序列数量的报告mRNA。结果显示，三个GCN4重复序列就足以实现50.6%的OMM中位mRNA定位，这表明仅需三个dCas13结合位点即可有效介导RNA组织。
gRNA数量：单条gRNA即可诱导GAPDH mRNA定位到OMM，但两条或三条gRNA能够显著提高效率。这提示dCas13结合位点对目标mRNA具有多价效应。
gRNA设计原则：研究人员进一步探索了影响CRISPR-TO性能的gRNA设计因素。通过线性回归和置换特征重要性分析，他们发现读取覆盖度（read coverage）对CRISPR-TO效率具有最强的正向影响（置换均值0.30，系数0.49），而脱靶命中（off-target hits）则表现出最显著的负面效应（置换均值0.23，系数-0.44）。gRNA二级结构的影响相对较小。这提示，选择3'UTR区域中具有中等读取覆盖度并最大程度减少脱靶的gRNA靶点，能够实现更好的CRISPR-TO效率。
值得关注的是，CRISPR-TO对目标RNA的稳定性、分布和翻译影响有限。六种内源性mRNA的折叠变化率均低于20%，这表明CRISPR-TO通过靶向3'UTR对RNA的这些基本属性影响极小。此外，CRISPR-TO的脱靶潜力较低。对不匹配gRNA的检测显示，75%的不匹配gRNA显著降低了RNA重定位效率，表明CRISPR-TO对错配敏感。使用两条gRNA能够进一步增强特异性，因为同时结合两条gRNA的脱靶RNA可能性较低。
RNA的“环球旅行”：定位多细胞器！
CRISPR-TO的通用性远不止OMM。研究人员将其应用范围扩展到六个额外的亚细胞区室，包括：
细胞质P-小体（cytoplasmic p-bodies）：GAPDH mRNA的富集率达到15.4%，对照组分别为7.0%和4.2%。
应激颗粒（stress granules）：GAPDH mRNA的富集率高达54.1%，对照组分别为20.2%和20.1%。
核端粒（nuclear telomeres）：TERRA非编码RNA在端粒上的定位从对照组的23.3%-26.8%提高到40.2%。
核应激体（nuclear stress bodies）：报告mRNA的定位率达到33.0%，对照组分别为17.9%和10.9%。
这些结果证实了CRISPR-TO能够通过将PYL1与不同的亚细胞定位信号或分子马达蛋白融合，实现对RNA的精准定位。
CRISPR-TO还被用于研究P-小体在mRNA周转中的作用。当将GAPDH mRNA招募到P-小体时，GAPDH mRNA的丰度增加了1.3倍。此外，靶向定位报告mRNA到P-小体显著降低了mRNA衰变常数（从0.041 h^-1降至0.031 h^-1），并增加了mRNA半衰期（从16.9 h增至22.7 h）。这些发现支持了P-小体作为mRNA储存而非降解位点的模型。
除了被动扩散和停靠，CRISPR-TO还实现了沿着微管的主动RNA运输。通过将PYL1连接到小鼠驱动蛋白KIF5B（前向运输，KIF5B，负责将货物运往微管正端）和人驱动蛋白KIFC1（逆向运输，KIFC1，负责将货物运往微管负端），研究人员成功将内源性GAPDH mRNA分别导向微管正端（细胞前沿）或负端（中心体）。统计分析显示，69.0%的转染细胞在细胞前沿积累了GAPDH mRNA，而23.9%的细胞在中心体积累了GAPDH mRNA，均显著高于对照组。
CRISPR-TO的“时间魔法”：可诱导与可逆的动态操控
与以往方法不同，CRISPR-TO最独特的优势在于其可诱导性和可逆性，实现了活细胞中RNA定位的精确时间控制。
研究发现，在添加ABA后，dCas13在10分钟内迅速定位到OMM，而mRNA的定位则在30分钟后观察到，并于4小时内达到平台期。这表明核糖核蛋白复合物的动力学比游离蛋白慢。当ABA被移除后，dCas13和GAPDH mRNA均以相似的快速率解离，在1小时内恢复到基线水平。这种快速可逆性使CRISPR-TO成为实时操控RNA定位动力学的强大工具。
研究人员利用CRISPR-TO的可诱导性，在U2OS骨肉瘤细胞系中追踪了报告mRNA的实时运输动态。结果显示，报告mRNA颗粒的平均运输速度为0.57 ± 0.14 µm/s，与已报道的哺乳动物细胞中MS2标记mRNA向中心体运输的速度（0.5-1 µm/s）一致。轨迹分析揭示了两种不同的mRNA群体：一种表现出受限的亚扩散运动（sub-diffusive motion），可能是由于细胞质的拥挤；另一种则表现出超扩散运动（super-diffusive motion），对应于沿微管的主动运输。
神经元里的“RNA奇遇记”：精准操控与实时观察
神经元是高度极化的细胞，RNA的精准定位对其功能至关重要。CRISPR-TO在原代小鼠皮层神经元中的应用，无疑是其最具突破性的亮点之一。
研究人员使用KIF5A蛋白将内源性ACTB mRNA（一种在神经元生长和再生中发挥关键作用的RNA）运输到神经元的轴突末梢（neurite tips）。他们首先证实CRISPR-TO组分和ABA处理对原代神经元培养物没有显著的神经毒性，这为后续的神经元实验奠定了基础。
在ABA处理24小时后，ACTB mRNA在神经元末梢的定位强度与DMSO对照组相比，增加了十倍。每个神经元末梢包含中位5个ACTB mRNA颗粒，而对照组中为零。沿着神经元的ACTB mRNA颗粒密度增加了3.2倍，达到每微米0.07个颗粒。此外，CRISPR-TO还能同时定位多种RNA，例如ACTB mRNA和Gap43 mRNA，进一步证实了其在神经元中的特异性。
与在OMM上的快速解离不同，ACTB mRNA从神经元末梢的释放速度较慢，24小时后仍能检测到中等水平。这可能表明在神经元末梢局部定位的mRNA周转率较慢。
局部翻译：让RNA在“远方”也能大显身手！
RNA在神经元末梢的局部翻译对于轴突生长、导向等过程至关重要。CRISPR-TO不仅能定位RNA，还能促进其局部翻译。
研究人员使用一种可光转换的荧光报告蛋白Dendra2来追踪局部翻译。在ABA处理下，神经元末梢的Dendra2绿色荧光恢复速度显著加快，这表明局部翻译更加活跃。翻译抑制剂（如嘌呤霉素和茴香霉素）能够完全消除这种恢复，进一步证实了活跃的局部翻译。
双色RNA FISH实验显示，在ABA处理的神经元中，ACTB mRNA与核糖体（ribosomes）在神经元末梢大量共定位，66%的ACTB mRNA颗粒与核糖体共定位，提示神经元末梢存在丰富的核糖体，可用于局部翻译。超分辨率显微镜STORM成像进一步证实，ACTB mRNA、核糖体和活性翻译位点（通过嘌呤霉素标记）在神经元末梢簇集并共定位，表明局部翻译确实发生。尽管如此，只有一小部分被运输的mRNA处于活跃翻译状态。
活细胞成像也捕捉到信使RNA（reporter mRNA）的动态，其中一些表现出沿神经元移动的更慢的运动速度，这与活跃翻译的mRNA特征一致。这些发现共同表明，核糖体可能与mRNA一同作为“乘客”从胞体运输到神经元末梢，为局部翻译提供了物质基础。
RNA的“形态魔术”：调控神经元生长与再生
既然CRISPR-TO能够精准定位RNA，那么它能否影响神经元的形态和功能呢？研究人员将内源性ACTB mRNA运输到原代小鼠皮层神经元的轴突末梢，并观察其形态变化。
实验发现，在ABA处理90分钟后，神经元末梢出现了多个动态的丝状伪足（filopodial protrusions），每末梢1-4个。而对照组（即使dCas13富集，但无靶向RNA）则没有形成伪足。在长达7小时的观察中，33%的神经元末梢在ABA处理后形成了动态伪足，远高于DMSO对照组的16%。RNA FISH证实了内源性ACTB mRNA在神经元末梢的增加。
然而，令人惊讶的是，尽管ACTB mRNA定位增加了丝状伪足的形成，但它却抑制了轴突再生。在轴突损伤模型中，ABA处理显著增加了轴突ACTB mRNA的定位。但在轴突切断后，靶向gRNA处理的神经元在ABA处理下，轴突长度显著缩短。这揭示了ACTB mRNA定位与神经元形态和再生之间一种出人意料的复杂关系。
海量筛选：解锁更多RNA功能密码！
CRISPR-TO的可编程性使其能够进行高通量遗传筛选，系统地探索空间RNA定位的功能作用。作为概念验证，研究人员进行了CRISPR-TO阵列筛选，以检查21种候选mRNA的神经元定位对神经元生长的影响。这些候选mRNA编码的蛋白都与神经元生长或再生有关。
筛选结果令人惊喜，研究人员识别出四种对神经元生长有显著影响的mRNA：Stmn2、L1cam、Tmsb4x和Rptor。其中，Stmn2编码的Stathmin-2是一种微管结合蛋白，参与微管动力学、轴突再生和肌萎缩侧索硬化症的病理过程。
RNA FISH验证显示，尽管Stmn2 mRNA在对照组的胞体和胞体近端神经元中也有发现，但CRISPR-TO扰动（gT + ABA）能够有效地将Stmn2 mRNA招募到神经元末梢，每个神经元末梢中位有3个mRNA颗粒，而对照组中则为零。随后的神经元生长实验也证实了Stmn2 mRNA定位的功能作用：在ABA处理12小时后，表达靶向gRNA的神经元与非靶向gRNA对照组相比，神经元长度显著增加。而逆向运输Stmn2 mRNA则对神经元生长没有显著影响。这明确表明，Stmn2 mRNA在神经元末梢的特异性定位能够促进神经元生长。
CRISPR-TO：开启空间转录组学新纪元
CRISPR-TO的出现，无疑是空间转录组学领域的一项里程碑式突破。它克服了传统方法的诸多局限，展现出多重优势：
无需基因组改造：直接结合内源性RNA，简化了操作流程。
多功能定位：能够将RNA定位到多种亚细胞区室，包括OMM、P-小体、应激颗粒、端粒、核应激体以及微管正负端。
精准时空控制：可诱导和可逆的特性，使得实时研究RNA定位动力学成为可能。
适用于原代细胞：特别是在神经元等复杂原代细胞中的高效应用，为疾病研究提供了关键工具。
高通量筛选潜力：通过改变gRNA序列，可编程地靶向不同RNA，实现大规模功能性筛选。
当然，CRISPR-TO目前仍有提升空间，例如多组分递送的复杂性以及dCas13蛋白质的进一步优化。但可以预见的是，随着技术的发展，未来有望实现单载体系统、更紧凑的dCas13变体，以及由计算算法优化gRNA效率和特异性。
CRISPR-TO不仅弥合了测序和成像技术留下的关键空白，更提供了一个通用平台，用于在活细胞和生物体中高通量地功能性探究RNA定位。这项技术有望为我们深入理解空间RNA组织在各种细胞类型和疾病背景下的生物学功能，提供宝贵的见解。RNA的“时空穿梭机”已经启动，让我们拭目以待，它将如何重塑我们对生命编程的认知！
参考文献
Han M, Fu ML, Zhu Y, Choi AA, Li E, Bezney J, Cai S, Miles L, Ma Y, Qi LS. Programmable control of spatial transcriptome in live cells and neurons. Nature. 2025 May 21. doi: 10.1038/s41586-025-09020-z. Epub ahead of print. PMID: 40399675.
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