2023年10月30日00:58:07 科学 1149

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尽管对硅酸盐生物活性玻璃（SBG）的研究已有50多年的历史，并取得商业上的成功，发表了6000多篇文章，但人们对SBG中释放的可溶性硅酸盐（Si）如何影响细胞反应仍然缺乏了解。

近日，来自英国皇家自由医院的Gavin Jell教授团队进行了生物活性玻璃释放的硅物质对细胞反应影响的相关综述。成果以“The Effect of Si Species Released from Bioactive Glasses on Cell Behaviour: A Quantitative Review”为题于9月14日发表在《Acta Biomaterials》上。

本文定量比较了文献中报道的细胞对SBG溶解产物的体外反应，并确定硅浓度（[Si]）是否对细胞行为产生了影响。细胞对溶解产物中SBGs [Si]的反应包括代谢活动（52%的文章有报道）、细胞数量（24%）、蛋白质生成（22%）、基因表达（22%）和生物矿化（24%）。据报道，引起细胞反应增加（理想）的[Si]（中位数=30.2ppm）与引起细胞反应减少（不理想）的[Si]（中位数=52.0ppm）存在差异（P≤0.001）。不良结果的频率随着[Si]的增加而增加，超过52ppm的不良结果比[Si]高出约3倍。本文还研究了[Si]对特定细胞行为（如代谢活性、血管生成、骨生成）的影响、细胞类型是否会影响这些反应以及SBG溶解物质中其他离子（Ca、P、Na）对细胞行为的影响。本综述首次定量比较了文献中细胞对SBG的反应，提供SBG体外定量的概述，并发现更有可能产生理想细胞反应[Si]的范围（30-52ppm）。该综述还表明有必要进一步规范体外研究方法，并提供一些最低标准。

图1 综述流程图

1. 将SBGs与更大的领域进行比较

搜索标准最初确定665篇体外研究文章，排除仅涉及体内数据（20%）、未对细胞对DPs反应进行定量评估（39%，例如细胞形态比较或缺乏未处理对照）或研究[Si]的文章（22%）。用于分析的研究文章以研究骨骼的文章为主（63%），其次是伤口愈合（17%）、牙科应用（12%）、免疫反应（5%）和软骨（3%）。在初步搜索时收集的文章（n=665）和被选中进行分析的文章中都发现类似的生物基因应用分布，表明所分析的文章在更广泛SBG领域具有代表性。

图2 Prisma图表明文章筛选过程和文章排除标准

2. 用于分析SBG溶解物质体外反应的方法

人类细胞（占文章总数的59%）、干细胞（占文章总数的39%）和成骨细胞（占文章总数的34%）是研究SBG DPs及其细胞相互作用最常用的细胞（按物种和细胞类型分别计算）。代谢活性测定是最常描述的细胞结果（68%的文章），可能由于10993 ISO标准建议描述细胞代谢活性对医疗器械的反应。所使用的代谢测定方式差异很大，最常见的是MTT和WST-8测定（分别占文章的51%和29%）。与需要溶剂溶解不溶性晶体的MTT相比，产生可溶性产物的代谢测定（如WST-1、WST-8、Presto和阿拉玛蓝）在过去五年中使用得更频繁。过去五年中MTT的使用率（占研究代谢活性文章的33%）低于前五年（2016-2011年，占67%）。虽然大多数文章都使用代谢活性测定法，但只有约2%的文章对该数据（按细胞数计算的代谢活性）进行归一化处理。只有24%的文章直接测量细胞数量（而不是代谢活性），其中85%的文章对裂解细胞的DNA进行了量化。研究SBG DP相互作用最常用的细胞培养时间点是3个时间点（评估代谢活性时）（1、3、7天的文章占24%）。约25%的文章使用了2个时间点或更少（1天和2天的文章占15%）。在分析称体外骨结节形成或生物矿化的研究中（12%的文章），钙沉积的量化是最常见的测量方法（90%的文章），而结节面积（7%）和结节数量（3%）则是最常见的结果测量方法。

最常见的生物活性玻璃成分（符合搜索标准）是45S5 Bioglass®（占文章总数的30%），而商业成分S53P4（Bonalive®）占文章总数的3%。体外研究的溶胶玻璃成分为58S和70S30C，分别占12%和1%，熔融衍生的成分占1%。约有54%的文章报告在搜索标准中每篇文章独有的SBG成分，这些文章通常是在研究添加到基本SBG成分中的额外治疗性离子（如Co、Sr、Li）的效果。镁和锶（均占文章总数的10%）是最常见的附加离子。用于研究SBG DPs与细胞（体外）相互作用的细胞培养基中平均[Si]为37.8ppm±36.6。对某些细胞和物种类型来说，研究人员（平均）使用了不同的[Si]浓度。与非人体细胞相比，人体细胞使用了更高的[Si]浓度；与非干细胞相比，使用干细胞的研究使用了更高的[Si]浓度范围。

3. 硅浓度会影响细胞反应吗？

综合所有细胞反应，[Si]浓度对细胞行为有依赖性影响，其中[Si]导致效应增加（正效应）高于无显著差异的[Si]，但低于导致效应减少（负效应）的[Si]。报告最多的结果是[Si]对细胞反应的影响，与没有SBGs的未处理对照组相比没有显著差异（无变化）。相比之下，有437个[Si]数据点报告的结果明显增加，157个数据点报告的结果明显减少。随着[Si]的增加，出现负面结果的频率也在增加。在52ppm的[Si]以上，出现负面结果的频率增加了约3倍。在[Si]为30-60ppm的范围内，报告的阳性结果的频率最高。然而，[Si]与细胞反应的程度（与未使用SBG DPs的未处理对照的百分比差异）之间只有很弱的负相关（R=-0.08）。

图3 生物活性玻璃中释放的[Si]对细胞行为的影响

4. 细胞类型和种类是否会影响对溶解产物的整体反应？

据报道，对人体细胞造成降低（负面）结果的[Si]平均高于非人体细胞，表明人体细胞可以耐受较高的[Si]浓度。据报道，人类细胞和非人类细胞在导致正面结果的[Si]方面没有差异。不过，使用人类细胞进行研究发现，[Si]的中位数明显高于使用非人类细胞进行的研究。因此，人体细胞研究中更高的[Si]范围可能是造成人体细胞与非人体细胞之间差异的原因，而不是细胞的特定反应。细胞类型（原代细胞与非原代细胞，或干细胞与非干细胞）并不影响[Si]对细胞产生的阴性或阳性反应。虽然用于研究原代细胞和非原代细胞的[Si]范围没有显著差异，但用于研究干细胞的平均[Si]与用于研究非干细胞的平均[Si]之间存在差异。考虑到[Si]越高，负面影响越大，干细胞和非干细胞之间没有差异，可能表明干细胞（与非干细胞相比）对越高浓度范围的[Si]耐受性越强。

图4 特定物种细胞对生物活性玻璃和陶瓷释放[Si]的反应

5. [硅]会影响细胞代谢活动、细胞数量和死亡吗？

代谢活性是用于分析细胞对SBG DPs反应的最常见细胞检测方法（52%的文章），其产生的趋势与细胞总体反应相似，即随着[Si]的增加，代谢活性反应中出现负反应的频率增加。使用百万分之90或以上[Si]的研究并未报告新陈代谢活动增加。值得注意的是，据报道在人类细胞中导致代谢活动降低的[Si]高于导致阳性结果的[Si]，但在非人类细胞中却没有观察到这种情况。在代谢活性、细胞数量或细胞死亡对[Si]的反应方面，没有观察到其他物种或细胞类型的特定差异。细胞数量的趋势与代谢活性类似，[Si]高于40ppm会增加细胞间不良相互作用的频率。不过，报告的[Si]对细胞数量的增加或减少没有差别，报告最多的结果是[Si]没有显著改变细胞数量。在增加细胞死亡的平均[Si]方面也没有观察到明显差异。不过，随着[Si]的增加，报告的细胞死亡结果的频率也在增加，据报告，44%高于60ppm的数据点会导致细胞死亡，而低于60ppm的数据点只有2%。

图5 生物活性玻璃释放的[Si]对细胞代谢活动、增殖和细胞死亡的影响

6. [Si]对成骨和血管生成反应有影响吗？

在[Si]与成骨细胞分化标志物（骨钙素和ALP活性）、生物矿化或血管内皮生长因子产生之间没有观察到明显差异。如果只考虑干细胞的分化（9篇文章），情况也是如此，即[Si]与成骨/血管生成的增加或减少没有差异。鉴于成骨分化不同阶段ALP表达的差异，还考虑了细胞培养时间的影响。在分析的任何时间点（一周、两周或三周）都没有观察到ALP活性的差异。然而，报道ALP活性因[Si]而增加的文章比ALP活性降低的文章多3倍。大多数研究（70%的文章，75%的数据点）将ALP酶活性与细胞数量（DNA总量）或蛋白质总量归一化，但只有33%的文章（30%的数据点和文章）将骨钙素或血管内皮生长因子的产生与细胞数量归一化。在没有归一化的情况下，很难确定[Si]对ALP活性的影响是由于细胞数量差异还是由于单个细胞的反应。不过，[Si]对ALP归一化或非归一化数据的影响没有差异。有几种不同方法用于确定生物矿化度，其中最常用的是茜素红染色法，其次是元素分析法和结核（数量和面积）量化法。通过氯化十六烷基吡啶萃取法（最常用的量化方法）量化钙量的文章中，[Si]与钙沉积之间没有关系。将所有基因表达对[Si]的反应综合起来，与其他细胞反应类似，与基因表达减少相关的平均[Si]高于导致基因表达增加的[Si]。研究中最常见的基因与成骨分化（如RUNX-1、OSX、BSP、ALP、BMP）、细胞外基质（ECM）生成（I型胶原）或血管生成（血管内皮生长因子）有关，这些基因表达的增加通常代表组织再生状态。当[Si]较高时，VEGF、ALP、OCN、OSN、RUNX-2和胶原T1的基因表达量减少，但OSX和BSP的基因表达量出现相反的情况。

图6 [硅]对不同细胞类型特异性反应的影响

7. SBG的类型会影响细胞反应吗？

为各种医疗应用生产了不同的SBG成分，但尚不清楚BG类型与体外细胞结果之间是否存在共性。在数据集中，最常用的SBG成分是熔融衍生的45S5 Bioglass®（23篇文章），其次是溶胶衍生的58S（9篇文章）。比较了所有熔融衍生的BG（仅含Si、Ca、P、Na）、45S5 Bioglass®、58S玻璃和含有额外治疗离子（如Sr、Co、Mg）的玻璃对细胞的影响。与其他类型的玻璃相比，在[Si]较高的情况下，细胞对58S DPs会产生负向或正向反应。不过，58S研究中的[Si]范围高于其他SBG。研究发现，其他治疗离子会改变细胞对[Si]浓度的反应，与45S5相比，[Si]浓度越低，细胞反应越好；与45S5相比，[Si]浓度越高，细胞反应越消极。考虑到Si和治疗离子是按比例释放的，可能表明治疗离子对细胞反应的影响。

图7 玻璃类型和[Si]

8. 钙、钠和磷离子对BG溶解产物的影响

除[Si]之外，SBG释放的其他离子浓度也可影响细胞的相互作用。因此，本文还比较了钙、磷和钠（分别为[Ca]、[P]和[Na]）浓度对细胞行为的影响。与[Si]浓度对细胞行为的影响相反，据报道对细胞有负面影响的[P]浓度低于有正面影响的[P]浓度。[Na]对细胞也有类似的影响，与产生积极影响的[Na]中值相比，产生消极影响的[Na]中值较低。在[Ca]对细胞行为的影响方面没有发现明显差异。接着还研究了这些离子是否会影响硅对细胞行为产生影响的浓度。将每种离子（[Ca]、[P]、[Na]）的浓度范围分成大小相同的"高"、"中"和"低"组。在SBG中发现，细胞对[Si]的反应与在所有数据中观察到的类似，[Si]浓度越高，结果越负面。然而，"低"[Ca]组（41.6-0ppm）与高[Ca]组（125-83ppm）相比，[Si]导致的负面结果与正面结果之间的平均值差异更大，表明钙可能会影响[Si]对细胞行为的影响。此外，[磷]似乎有相反的作用，在SBG培养基磷含量较高的组中，细胞对[Si]的反应差异较大（报告的负面或正面效应的差异），而[磷]浓度"低"（13.3-0 ppm）的组中，细胞对[Si]的反应没有差异。在任何组别中都没有观察到[Si]和[Na]之间的明显趋势。

图8 [Ca]、[Na]和[P]对细胞整体反应的影响

9. 研究单独的Si种类和BG溶解产物对细胞行为的影响差异

为研究硅离子是否能独立于BG中释放的其他离子（Na、Ca和P）影响细胞反应，本文收集了更多关于硅离子（非BG DPs产生）单独影响的文章（22篇）。与BG条件培养基类似，随着[Si]的增加，单独的Si离子也会导致越来越多的负面结果。据报道，导致负面结果的[Si]中位数与导致无变化的[Si]中位数和导致正面结果的[Si]中位数有显著差异。与SBG DPs对[Si]的反应相比，这些硅浓度明显较低。然而，单独使用硅离子时的[Si]范围与DPs中的[Si]范围相比存在差异，可能是解释SBGs DPs与单独使用硅之间差异的一个干扰因素。硅酸钠是调节细胞培养基最常见的硅前体（65%的文章），氯化硅（13%）和硅酸钙（8%）也被研究过。在硅源和细胞结果之间没有发现差异。

图9 非溶解产物中的硅对细胞反应的影响

10. 总结与展望

本综述首次尝试量化生物活性玻璃中释放的硅对体外细胞反应的影响。定量分析显示，SBG DPs中[Si]含量越高，报告的负面结果出现频率就越高，但更有可能出现负面结果的特定浓度以及更有可能出现理想细胞反应的[Si]浓度，对于调整新型SBG的硅释放量非常有用。本研究采用的方法也是一种新颖的方法，可用于比较方法差异较大的复杂研究（如不同的细胞类型、实验条件和用于评估细胞反应的方法）。BGs体外表征方法的标准化会让人们更深入了解[Si]的浓度依赖效应，并理解其在细胞反应中的各种作用。

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