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文|嫋嫋
编辑|嫋嫋
前言
蛋白质和核酸可以通过液-液相分离形成无膜细胞器，用于在空间上组织细胞成分和反应。少突胶质细胞中，RNA 结合蛋白异质核核糖核蛋白 A2在运输颗粒的MLO中携带mRNA靶标。
hnRNPA2会被酪氨酸蛋白激酶Fyn磷酸化，从而释放mRNA。Fyn通过其SH3与hnRNPA2发生相互作用，但是hnRNPA2缺乏规范的SH3结合序列。
在Fyn-SH3表面确定hnRNPA2 LC的相互作用位点，提供了hnRNPA2 LC与Fyn相互作用的结构视图，并展示单球状结构域如何诱导无序MLO支架蛋白的相分离。
液-液相分离是一种被提议用于形成无膜细胞器的机制，MLO的LLPS可以在空间上组织细胞成分，并且由于浓缩反应物而被认为能够加速酶促反应或者通过提供独特的化学环境实现功能。
LLPS是一个平衡过程，涉及分子组装成两个或多个不同的相，这些相的浓度、结构和接触可能不同。不同的MLO在细胞中执行不同的功能，并由多种细胞成分组成。RNA颗粒是一类富含RNA和RNA结合蛋白的MLO。
Fyn-SH3 与 hnRNPA2 LC 相互作用
hnRNPA2是一种RNA结合蛋白，参与前mRNA剪接、翻译控制和mRNA运输。它的结构域包括两个N端的RNA识别基序，它们一起结合到被称为A2响应元件的共有RNA序列上，随后是低氨基酸序列复杂性的本质无序结构域。
hnRNPA2形成mRNA转运颗粒，将mRNA带到树突和少突胶质细胞的局部翻译位点。当颗粒到达局部翻译位点时，Src家族酪氨酸激酶Fyn会磷酸化hnRNPA2，从而释放用于翻译的mRNA分子。
Fyn激酶除了催化结构域外还由几个不同的Src同源结构域组成，其中SH3结构域介导蛋白质与目标蛋白质之间的相互作用，可能结合含有PXXP基序的肽，而SH2结构域主要与磷酸化酪氨酸结合。
Fyn最初处于封闭状态，但在被磷酸化和激活时，它采取开放构象，使得SH2和SH3结构域可以与下游的靶标发生相互作用。
hnRNPA2和Fyn之间的功能相互作用，但Fyn激酶和hnRNPA2之间的物理相互作用仍不清楚，因为hnRNPA2缺乏典型的SH3结合基序。
利用核磁共振波谱Fyn-SH3与hnRNPA2 LC相互作用的区域，向未标记的hnRNPA2 LC中加入15N标记的Fyn-SH3来观察其对NMR谱的影响，添加0.25摩尔当量的hnRNPA2 LC导致样品呈现乳光与液液相分离一致。
随着hnRNPA2 LC浓度进一步增加，NMR信号明显降低，当15N标记的Fyn-SH3与hnRNPA2 LC的比例为1:2.5时，NMR信号完全消失。
Fyn-SH3滴定15N标记的hnRNPA2 LC时，随着比例变为1:0.5，hnRNPA2 LC-Fyn-SH3的强度下降，而在1:1时信号完全消失，单独使用hnRNPA2 LC不会发生相分离。
用带有N端麦芽糖结合蛋白溶解度标签的高度溶解的hnRNPA2 LC，即使在1:0.5的比例下混合标记的Fyn-SH3和MBP-hnRNPA2 LC，表明形成了大的NMR不可见物质，并且溶液变得浑浊。Fyn-SH3强烈诱导hnRNPA2 LC的相分离。
Fyn激活引发hnRNPA2和其他颗粒成分
混合后15N标记的hnRNPA2 LC至Fyn-SH3滴定的NMR信号强度降低且光学浊度增强。为了量化hnRNPA2 LC的相分离与Fyn-SH3浓度的关系，随着Fyn-SH3浓度的增加，hnRNPA2 LC WT的浊度增加至等摩尔浓度的Fyn-SH3。
在6小时内每次滴定的浊度短暂增加，然后逐渐恢复到基线水平，这可能是由于液滴粗化或沉降和粘附到孔壁所致。
在1:1和1:2时，观察到相似的时间过程和最大浊度值。仅在1:10时，浊度在6小时时间点之前还没有恢复到基线。随着Fyn-SH3浓度的增加，D290V和P298L样品的浊度也增加，与hnRNPA2 LC WT相似。
对比Fyn-SH3和hnRNPA2 LC样品观察到的浊度是由液液相分离引起的，在Fyn-SH3上放置了Alexa Fluor标签，并通过突变表面暴露的丝氨酸残基为半胱氨酸，使其远离已知的脯氨酸结合位点。
在0mM NaCl缓冲液中，添加Fyn-SH3会诱导hnRNPA2 LC WT液滴的形成，而单独的hnRNPA2 LC在这种浓度和溶液条件下不会发生相分离。荧光显微镜数据表明Fyn-SH3融入了液滴中。此外，Fyn-SH3也诱导hnRNPA2 LC D290V突变体的液滴形成。
在增加盐浓度下以确定Fyn-SH3是否在生理盐条件下与hnRNPA2 LC的LLPS液滴相互作用。无论NaCl浓度如何，Fyn-SH3掺入hnRNPA2 LC WT液滴中，并且液滴的形态没有改变。
这些结果表明Fyn-SH3和hnRNPA2 LC之间的相互作用不是由NMR实验所用的低盐条件造成的。
hnRNPA2突变体D290V和P298L导致液液相分离的hnRNPA2 LC液滴转化为蛋白质聚集体。与Fyn-SH3结合会破坏或促进hnRNPA2从液体形式转化为与疾病相关的聚集形式，对hnRNPA2 LC及其突变体D290V和P298L进行了孵育，其中有或没有Fyn-SH3参与。
将Fyn-SH3添加到hnRNPA2 LC WT中并没有改变液滴的形态，液滴主要保持圆形。相比之下，3小时后，没有Fyn-SH3的情况下，hnRNPA2 LC突变蛋白呈现出不规则形状，与不可逆聚集的形成一致。
然而，当将Fyn-SH3添加到hnRNPA2 LC P298L突变体中时，3小时后，聚集转变为不规则结构，而液滴形态再次出现。对于D290V突变体，同时观察到聚集和液滴，但不如P298L突变体那么显著。
此外，Fyn-SH3仍然会融入hnRNPA2 LC P298L液滴中，尽管随着时间的推移有聚集的趋势。盐对hnRNPA2突变体聚集的影响，使用生理学150mM NaCl的缓冲液代替0mM NaCl。
与低盐不同，即使存在Fyn-SH3，hnRNPA2 LC在150mM NaCl下仍然聚集。3小时后，无论有或没有Fyn-SH3，WT、D290V和P298L样品仍然聚集。因此，Fyn-SH3无法在所有测试条件下阻止hnRNPA2 LC聚集。
Fyn-SH3 可能会减少 hnRNPA2相关突变体的聚集
然而，由于hnRNPA2 LC在添加Fyn-SH3后发生相分离，导致相互作用的蛋白质被发送到粘稠的相分离液滴中，这些液滴很难通过溶液NMR检测到。
为了在NMR中识别相互作用位点，较小的hnRNPA2 LC片段将阻碍LLPS，但保留与Fyn-SH3结合的能力，从包含残基266-341的hnRNPA2亚肽开始，在hnRNPA2中该结构域包含在hnRNPA2相关退行性中发生突变的残基。
该亚肽还包含LC中9个脯氨酸残基中的4个，它们可能充当SH3结构域的结合位点。幸运的是，在NMR缓冲液中测试的Fyn-SH3和hnRNPA2 266-341的混合物并未显示出相分离现象。
用15N标记的Fyn-SH3与含有hnRNPA2 266-341的亚肽进行了1:1、1:1.5和1:2的滴定，并观察到Fyn-SH3共振的化学位移扰动随着hnRNPA2亚肽浓度的增加而增加，这表明Fyn-SH3和hnRNPA2 LC之间存在相互作用。
化学位移扰动主要出现在Fyn-SH3的RT环、β4链和远端环中，与Fyn-SH3的结合表面区域重叠。尤其在β4链上的Thr-53和Gly-54以及RT环中的Leu-24显示出最高的位移。
尽管这些混合物是稳定的并且不易发生相分离，但在1:2时，强度比降低至约0.7，这可能是由于高阶组装体的形成而发生的。
用15N标记的hnRNPA2 266-341与自然丰度的Fyn-SH3进行整个亚肽中的化学位移扰动，但在310-320区域观察到一组较大的15N位移，表明Fyn-SH3与该区域的结合增加。
当Fyn-SH3以5摩尔当量添加到hnRNPA2 266–341中时，观察到轻微浑浊和信号损失，但仍保留约60%的1:1信号，表明Fyn-SH3仍然可以诱导hnRNPA2的这个小截短的相分离。
用hnRNPA2 190-303的亚肽时，在标准条件下它立即沉淀。因此，在较低的pHhnRNPA2 LC不易组装。在这种条件下，hnRNPA2 190-303在添加等摩尔的Fyn-SH3后发生相分离。
因此，发生了蛋白质-蛋白质相互作用，但无法通过NMR对相互作用的位点特异性细节进行直接评估。该亚肽比266-341亚肽具有更多的脯氨酸残基，因此，该区域可能是Fyn-SH3与hnRNPA2相互作用。
这些残基在许多SH3结构域中都是保守的，表明它们对SH3功能很重要。Fyn-SH3 RT环中的残基Asp-23和Leu-24在hnRNPA2 266-341中存在时表现出较大的化学位移扰动，这与其他研究中观察到的富含脯氨酸的蛋白质结合的情况相似。
此外，截短的hnRNPA2 LC到Fyn-SH3结合时的一些化学位移扰动，其中最大的位移位于残基314-325，该区域包含脯氨酸-酪氨酸核定位信号，可结合核转运蛋白β-2。这暗示PY-NLS可能是hnRNPA2 LC中与Fyn-SH3结合的主要位点。
然而，完整的LC和N端片段与Fyn-SH3混合时，形成了比截短的266-341亚肽更低浓度的相分离，这可能是由于更高的亲和力结合导致的。
总结
对于hnRNPA2 LC与Fyn-SH3的相互作用，Fyn-SH3-hnRNPA2接触的模型。单个Fyn-SH3结构域可能是hnRNPA2 LC的多价结合平台，存在多个位点可以与hnRNPA2 LC结合，这种多价接触可能导致hnRNPA2 LC分子之间的相互作用增强。
使Fyn-SH3诱导hnRNPA2 LC LLPS的生理作用不太可能，因为在hnRNPA2与存在于局部翻译位点的膜束缚Fyn激酶相互作用时，hnRNPA2已经发生相分离。
相反，Fyn-SH3-hnRNPA2接触可能有助于将Fyn掺入hnRNPA2颗粒中，从而在空间上控制Fyn和hnRNPA2激酶结构域的相互作用，导致hnRNPA2在需要局部翻译的位点被磷酸化和颗粒解聚。
这种严格的空间和时间调控对于确保mRNA仅在需要的时间和地点进行翻译至关重要，然而，颗粒解聚的分子细节以及其他激酶是否也通过类似的机制将相分离颗粒解离。
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