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文 | 翟子
编辑 | 贺绪云
前言
在制革业和鞣革厂中，大量废弃物被处理掉，污染水、土壤和大气，导致严重的人体健康问题。特别是制革业的化学脱毛过程产生了大量的有毒废物。迫切需要使用无污染的替代工艺。由于羽毛中含有超过90％的角蛋白，希望开发使用角蛋白降解微生物的生物修复过程。
首先确定了可以产生角蛋白酶的蜡样芽孢杆菌和假单胞菌。进行了优化，以最大限度地提高角蛋白酶的活性，包括培养温度，pH和孵育时间。
还研究了金属离子和各种底物对角蛋白酶活性的影响。结果表明两种菌株的角蛋白酶活性在50°C时达到最大值，而B. cereus的最适pH为10.0，Pseudomonas sp.为7.0。
B. cereus的最高角蛋白酶活性为74.66 ± 1.52 U/mL，而Pseudomonas sp.为57.66 ± 2.52 U/mL。酶解脱毛效率也与化学脱毛进行了比较，经过粗角蛋白酶处理后，可实现完全脱毛。还进行了醋酸盐沉淀的部分酶纯化。在1L发酵罐中进行的B. cereus批量培养表明其是大规模角蛋白酶生产的潜在候选。
解决化学脱毛过程带来的高污染难题
制革业和鞣革厂虽然涉及高度污染的过程，提供了多样化的设施，用于生产能力以及出口潜力。制革过程需要多个步骤，包括脱毛、脱酸、软化、脱脂，最后按照级联方式进行酸洗，将原始皮革转化为耐用的成品材料，适用于鞋、裙子、裤子、帽子、夹克、腰带，以及书籍装订、家具覆盖等多种用途。
化学脱毛过程需要使用超过75种化学品，包括石灰和硫化物将原始皮革转化为半成品皮革，这在制革业中产生了约90％的总污染，并且产生有毒气体和固体废物。
之前的报告估计，在制革过程中产生了近1000千克固体废物中的近850千克，每处理1千克生皮/皮革需要使用约40至45升水。
这造成了许多困难，包括获得良好水源，处理废水以及脱毛过程中的硫化物排放。除了固体废物，预鞣、鞣革和复鞣过程中的生化需氧量和化学需氧量，以及总溶解固体，几乎占了70％的污染。
微生物角蛋白酶的工业应用
角蛋白酶被归类为蛋白酶，通过水解角蛋白，广泛应用于制革、洗涤剂、纺织、医药、化妆品、肥料、废物转化以及药物传递等多个行业。
角蛋白是脊椎动物上皮细胞中的一种不溶性结构蛋白，是皮肤及其附件的主要成分，具有很高的机械稳定性和对蛋白酶降解的抵抗性。羽毛中约占91％的成分是角蛋白蛋白质，8％为水，1％为脂质，世界范围内的家禽加工产业产生了大量的羽毛废料。
家禽羽毛富含角蛋白蛋白质，不容易被常规的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶等降解，通过角蛋白降解微生物降解富含角蛋白的羽毛废料对于去除羽毛废料以及提供有价值的蛋白质至关重要，这些蛋白质可以用作动物饲料、农业和化妆品工业的营养添加剂，以及有机农业的氮肥。
角蛋白降解菌包括蜡样芽孢杆菌属，革兰氏阴性菌，如假单胞菌属。蜡样芽孢杆菌属的角蛋白酶因其对羽毛的降解效果而被广泛研究。
角蛋白废物的化学处理被认为是对环境的一种破坏性方式，对环境产生负面影响，因此高度希望考虑角蛋白酶的工业应用。使用粗角蛋白酶进行环境友好型的酶法脱毛，并将其与两种传统使用的化学品进行比较。
在摇瓶培养中，优化了反应条件，考虑了各种操作参数。还尝试对粗角蛋白酶活性进行部分纯化。还通过在1升发酵罐中进行批量培养，在优化条件下生产粗角蛋白酶，以展示其可能的工业应用。
角蛋白酶产量与特性研究
角蛋白酶产量在不同的培养条件下进行了优化，包括温度、pH值、搅拌速度、孵育时间、接种量、底物以及碳源和氮源。通过研究细菌在不同温度°下以及不同pH范围进行72小时、84小时和96小时孵育的细菌生长情况，探究培养基温度、pH值和搅拌速度对细菌生长和角蛋白酶活性的影响。
孵育后，将培养液离心于4°C，4000转/分钟，30分钟，以测定角蛋白酶产量。在每种情况下，也测定了对照组，以比较相对角蛋白酶产量。
对粗角蛋白酶活性进行了部分特性鉴定，研究了不同的酶反应条件，如pH值、温度、反应时间、底物和金属离子，以寻找最佳的角蛋白酶活性。在pH值为4.0-11.0的条件下，通过使用乙酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液和碳酸氢钠-氢氧化钠来准备底物，测定了pH值对角蛋白酶活性的影响，并使用标准酶活性测定条件进行测量。
在50个土壤样品中，根据产生透明圈区域的情况，发现了7株蛋白酶活性细菌。从中选择了2株最佳角蛋白酶细菌。这可能是因为产生角蛋白酶的细菌也可以产生一个或多个其他特定的细菌蛋白酶，如碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胰蛋白酶。
为两种角蛋白酶产生细菌进行了16S rDNA扩增PCR，其中提取的基因组DNA在1%琼脂糖凝胶上显示出阳性带，与DNA 1 kb标记相比。从16S rDNA序列比较推断的同源性分析清楚地显示，这两株菌株分别与B. cereus和Pseudomonas sp.聚类，并在blast分析中具有100%的同一性。
所有结果都被提交到GenBank，其中B. cereus和Pseudomonas sp.分别被指定为MH430931和MH430929的进入号。BLAST相似性和系统发育分析表明，SA和SJ分离株分别被确认为B. cereus和Pseudomonas sp.。
微生物角蛋白酶产量优化与生物降解特性研究
B.cereus和Pseudomonas sp.的最佳生长速率分别在39°C和37°C的温度下达到，这与对B. subtilis和Bacillus pumilis的其他研究结果一致50。培养基的pH影响反应混合物，并帮助营养物质通过细菌的细胞膜。
研究中，两种角蛋白酶细菌在碱性条件下表现出最佳的角蛋白酶产量。这种倾向是由于在角蛋白降解过程中，肽和氨基酸的脱氨作用导致氨的释放，从而增加了pH。Gupta和Ramnani13也报道了在大多数微生物中，pH 6.0至9.0的碱性pH支持角蛋白酶的产生。
较高的搅拌速率可以提供良好的细菌生长，但可能由于溶解氧浓度较高而导致角蛋白酶产量较低。另一方面，Pissuwan和Suntornsuk51报告，在低搅拌速率下，底物和细菌细胞没有被充分混合，产生了异质形成，从而降低了溶解氧，导致了较低的角蛋白酶产量。
虽然羽毛降解可以在3至5天内完成，但它也需要超过5天的时间。Agrahari和Wadhwa52以及Yadav等53报道了Bacillus thurengenesis SN2和Bacillus菌株SAA5在第5天和第7天分别获得最大的角蛋白酶产量。
B. cereus在96小时的孵育中使用鸡毛羽获得了最高的角蛋白酶产量，而Pseudomonas sp.在72小时的孵育中获得了44.00±1.00 U/mL。
还测试了几种接种量，发现3%的接种量对于B. cereus和Pseudomonas sp.的最高角蛋白酶产量负责。随着接种量的进一步增加，酶的产量逐渐减少，这可能是由于细菌在生长早期迅速生长，消耗了必需的营养物质。Bacillus cereus和Pseudomonas sp.在羽毛粉中产生的角蛋白酶比原始羽毛高出2倍左右，人体头发作为底物也具有诱导性。
影响微生物角蛋白酶产生与特性的因素研究
碳源和氮源也影响角蛋白酶的产生，其中B cereus完全水解可溶性淀粉，而Pseudomonas sp.完全水解麦芽糖55。另一方面，乳糖对角蛋白酶的产生起到抑制作用。现酵母提取物提高了两种细菌的角蛋白酶产量56，而硫酸铵起到抑制作用。在优化之后，额外的碳源和氮源对角蛋白酶的产生没有刺激作用。
显示了培养条件对角蛋白酶活性的影响，其中图4A表明B. cereus和Pseudomonas sp.的角蛋白酶的最佳温度为50°C，因为大多数角蛋白酶在50°C至60°C范围内表现出热活性。
B cereus LAU在50°C和pH 7.0的条件下显示出最高的角蛋白酶活性，10,43而Microbacterium sp.的最大角蛋白酶活性出现在55°C和pH 7.0的条件下。B cereus的最佳角蛋白酶活性出现在pH 10.0，而Pseudomonas sp.在pH 7.0的条件下获得最高的角蛋白酶活性。
在反应时间对胞外角蛋白酶酶活性的影响显示，两种菌株的最高酶活性在30分钟时达到最高水平，将B. subtilis RSE163孵育在70°C下30分钟可增强角蛋白酶活性。
研究了不同金属离子的影响，与酶预先混合来研究它们对角蛋白酶活性的影响。Hg2+和Zn2+的抑制效应也被Kainoor和Naik56以及Lin和Yin58在Bacillus sp. JB 99和B. licheniformis YJ4的情况下所报道，与我们的研究结果是一致的。
角蛋白酶对复杂的蛋白质底物具有高效的水解作用，它在可溶性和不溶性底物方面具有广泛的底物特异性。角蛋白酶可以高效地水解鸡羽毛角蛋白，其次是酪蛋白、明胶和人体头发。得到了类似的发现，发现B. subtilis RSE163和B. pumilis KS12的最高角蛋白酶活性在鸡羽毛底物上。
微生物角蛋白酶的性能研究
通过低里法对B cereus和Pseudomonas sp.的角蛋白酶进行了粗蛋白质的估计，分别为0.73和0.57 mg/mL，与BSA的标准浓度相比。Deivasigamani和Alagappan60以前报道过，角蛋白酶产生的微生物中大约含有1.44 mg/mL的粗蛋白质。
为了研究鸡羽毛的降解率，在B. cereus的优化条件下进行了96小时的培养，而基础培养基的pH和温度分别为9.5和39°C，在96小时时发现最大的降解率为80%±0.025%。
尝试观察所产生的角蛋白酶酶在脱毛过程中与化学品的有效性，因为化学品会对皮革造成损害并降低其质量。将皮革片分别用酶和化学品浸泡总共16小时。在12小时后，使用酶实现了100%的脱毛效果，而化学品则导致皮革损坏。
16小时，Na2S对皮革造成了损害，而CaO的脱毛效果仍不完全。化学处理时，头发的纤维展现出粗糙的质地。来自B. cereus的粗角蛋白酶在12小时内获得了最佳的皮革脱毛效果，研究中的B. cereus61、Pseudomonas stutzeri K4、B cereus AT49、Pseudomonas aeroginosa MCM B-32763和B. safenis64的脱毛过程分别需要24、20、18、16至21和16小时。
丙酮沉淀对细胞自由上清液中的粗角蛋白酶进行部分纯化，去除其中的干扰元素。尽管丙酮是蛋白质的良好纯化试剂，但由于其具有变性倾向，在纯化过程中并不常用。对B. cereus和Pseudomonas sp.观察到最大的特异性活性在70%和50%饱和度水平，分别具有约1.35倍和约1.67倍的纯化倍数，这与Thangam和Rajkumar的报告不同。
除了烧瓶培养外，还进行了批量培养的大规模角蛋白酶生产研究，结果在培养4天后，角蛋白酶的产量为 U/mL，比烧瓶培养中的产量 U/mL增加了2倍。
结论
展示了B. cereus产生的角蛋白酶可以作为一种优秀的皮革脱毛剂，对皮革没有不良影响，而化学品会产生有害效果。所提出的角蛋白酶对家禽废料的降解不仅能够更好地进行脱毛，而且能够提高皮革的质量，相比化学品而言。
酶法脱毛减少了对孟加拉国鞣革业常用的有害化学品（硫化物、石灰和胺类）的依赖，从而减少了水、土壤和整体环境的污染，保护了人类健康和野生动物。
参考文献
【1】张婧，《角蛋白酶的定向进化及其对羽毛降解特性的研究》，江南大学，2023年。
【2】蒋彪，《角蛋白酶产生菌的筛选、发酵优化、酶学特性及应用》，湖北工业大学，2017年。
【3】徐志龙，《产角蛋白酶菌株的分离筛选和羽毛粉固态发酵的初步研究》，华中农业大学，2018年。
【4】舒伟学，《角蛋白酶高产菌株的选育及其产酶研究》，西北农林科技大学，2017年。
【5】胡洪，《角蛋白酶基因工程菌的构建和表达及重组酶酶学性质与功效研究》，四川农业大学，2014年。
