默克生命科學 | Duolink® PLA熒光實驗方案

2022年10月13日20:42:16 科學 1376

Duolink® PLA熒光實驗方案

本實驗方案描述了Duolink® PLA試劑用於組織和細胞樣品中個體蛋白質、蛋白質修飾和蛋白質相互作用的免疫熒光檢測、可視化和定量。如想了解Duolink® PLA技術，請下載我們的手冊並查閱如何優化Duolink® 鄰位連接測定以獲得更多詳細信息。有關其他實驗方案，請參閱Duolink® PLA明場實驗方案和Duolink® PLA Probemaker用戶指南。更多內容請到默克生命科學官網查看：www.sigmaaldrich.cn

材料和設備

Duolink

有關具體的產品建議，請參閱Duolink® PLA產品選擇指南。簡單來說，要運行用於熒光檢測的Duolink® PLP實驗，需要以下Duolink® PLA產品：

Duolink® PLA探針（一種PLUS和一種來自不同物種的MINUS，與您的一抗宿主物種相匹配）。每個試劑盒包括：注意：將試劑盒的所有組分存放在4°C溫度下。
注意：如果需要，可用Duolink® PLAProbemaker PLUS和/或Probemaker MINUS試劑盒生成定製的PLA探針。有關詳細信息，請參閱Probemaker指南。

PLA探針（5x）— PLUS和/或MINUS，取決於產品
封閉溶液 — 用於在孵育抗體前封閉樣品
抗體稀釋劑 — 用於稀釋PLA探針，而且如果需要，用於稀釋一抗

Duolink® 熒光檢測試劑（可選擇綠色、橙色、紅色和遠紅）。每個試劑盒包括：注意：將所有組分存放在-20°C溫度下。

連接原液（5x） – 稀釋以製備1x連接緩衝液
連接酶 (1 U/μL) – 添加以製備連接溶液
擴增原液 (5x) – 稀釋以製備1x擴增緩衝液
聚合酶 (10 U/μL) - 添加以製備擴增溶液

熒光用洗滌緩衝液（A和B）
含DAPI的Duolink® 封固劑（用於載玻片，儲存在2-8°C）或者核染色和防褪色劑（用於微孔板，儲存在-20°C）

其他材料

檢測目標蛋白質的一抗。當與Duolink® PLA探針一起使用時，必須在小鼠、兔子或山羊中飼養。
高純度純水（無菌過濾，Milli-Q®或類似水質）
載玻片上的樣品（細胞或組織），已經過固定、恢復和透化方面的預處理。關於下列主題的相關建議和詳細信息，請參閱如何優化Duolink®鄰近連接測定：

實驗設計和對照
選擇一抗和優化
樣品處理

設備

熒光顯微鏡，帶有適當的濾鏡、相機和用於圖像採集的軟件
37°C培養箱
搖床
加熱濕度箱或微孔板傳熱座
疏水筆，用於畫出反應區域
冷凍座（用於酶）
染色罐
鑷子
移液器和吸頭（1 μl至1000 μl）
與熒光顯微鏡兼容的蓋玻片

Duolink

以下實驗方案適用於載玻片上的1cm2樣品，需要40 μL溶液以充分覆蓋。根據您的反應面積和樣品數量調整體積。所有孵育均應在濕度箱中進行。所有洗滌步驟均應在室溫下在染色罐中進行，罐中至少有70 ml緩衝液，並輕輕攪拌。

製備試劑

洗滌緩衝液A和B應在開始測定之前製備，將一小袋內容物溶解在高純度純水中，定容1000 mL。溶液可以短時間儲存於室溫下（少於兩周）或者長期儲存於在4℃下。注意：使用前將溶液升溫至室溫。
開始測定之前，用高純度純水以1:100稀釋1x洗滌緩衝液B，製成0.01x洗滌緩衝液B。
許多Duolink® PLA試劑以濃縮原液形式提供，在使用前立即稀釋。請勿儲存稀釋後的Duolink® PLA試劑。

Duolink

在開始之前，將樣品沉積在載玻片上，並經過固定、恢復和/或透化方面的預處理。有關詳情，請參閱如何優化Duolink®鄰近連接測定。

封閉

渦旋Duolink®封閉液。
在每個1cm2樣品上添加1滴（~40 μL）Duolink® 封閉液。確保封閉液要覆蓋整個樣品。
將載玻片置於加熱濕度箱中37℃孵育60分鐘。

孵育一抗在添加抗體之前請勿讓載玻片乾燥，否則會導致背景。

渦旋Duolink®抗體稀釋劑。
在Duolink®抗體稀釋劑中稀釋一抗或抗體至合適濃度。
從載玻片上彈掉Duolink®封閉液
將一抗溶液添加到每個樣品中。
將載玻片置於濕度箱中孵育。用最佳孵育溫度和時間孵育一抗。

孵育Duolink® PLA探針

渦旋PLUS和MINUS PLA探針
在Duolink®抗體稀釋劑中以1:5稀釋PLUS和MINUS PLA探針。
對於40 μL反應，取8 μL PLA探針MINUS原液，8 μL PLA探針PLUS原液和24 μL抗體稀釋劑。為所有樣品製備足量的溶液。
從載玻片移除一抗溶液
在室溫下在1x洗滌緩衝液A中洗滌載玻片2x 5分鐘。
移除多餘的洗滌緩衝液，然後塗抹PLA探針溶液。
將載玻片置於預熱的濕度箱37℃孵育1小時。

連接
說明：連接酶要等到需要添加到樣品中時立即添加。確保連接緩衝液在使用前完全解凍並充分混合。

用高純度純水以1:5稀釋5x Duolink® 連接緩衝液並混合。
對於40 μL反應，將8 μL 5x連接緩衝液添加到32 μL高純度純水中。為所有樣品製備足量的溶液。
從載玻片移除PLA探針溶液。
在室溫下在1x洗滌緩衝液A中洗滌載玻片2x 5分鐘。
在洗滌過程中，使用冷凍座（-20°C）恢復從凍箱里取出的連接酶。
以1:40稀釋度將連接酶添加到步驟（a）中的1x連接緩衝液中，並混合。
對於40 μL連接溶液，將1 μL連接酶添加至39 μL的1x連接緩衝液中。
移除多餘的洗滌緩衝液，然後塗抹連接溶液。
將載玻片置於預熱的濕度箱37℃孵育30分鐘。

擴增
說明：聚合酶要等到需要添加到樣品中時立即添加。擴增緩衝液對光敏感。避免所有含有擴增緩衝液的溶液受到光照。

用高純度純水將5x擴增緩衝液以1:5稀釋並混合。對於40 μL反應，將8 μL 5x擴增緩衝液添加到32 μL高純度純水中。為所有樣品製備足量的溶液。
從載玻片移除連接溶液。
在室溫下在1x洗滌緩衝液A中洗滌載玻片2x 5分鐘。
在洗滌過程中，使用冷凍座（-20°C）恢復從凍箱里取出的聚合酶。
以1:80稀釋度將聚合酶添加到步驟（a）中的1x擴增緩衝液中，並混合。
移除多餘的洗滌緩衝液，然後塗抹擴增溶液。
將載玻片置於預熱的濕度箱37℃孵育100分鐘。

最終洗滌
說明：光敏試劑。始終避免保存載玻片。

從載玻片上移除擴增溶液。
在室溫下在1x洗滌緩衝液B中將載玻片洗滌2x 10分鐘。
在0.01x洗滌緩衝液B中洗滌載玻片1分鐘。

準備成像
說明：含DAPI的Duolink®原位封固劑是水性的，不會凝固。可以使用透明指甲油將蓋玻片的邊緣密封到載玻片上。避免蓋玻片下面夾帶氣泡。

從載玻片上移除多餘的洗滌緩衝液。
使用最小體積的含DAPI的Duolink®原位封片劑，用蓋玻片蓋好載玻片。
等待15分鐘，然後在熒光或共聚焦顯微鏡中分析，使用至少20x物鏡。
成像後，可將載玻片在黑暗中4°C下保存最多4天，或者在-20°C下保存最多6個月

結果

圖像採集

Duolink® PLA實驗的結果通常使用熒光顯微鏡觀察，用適當的濾鏡檢測熒光團。Duolink® PLA信號被認為是被研究的細胞的不同位置上的離散熒光點（見圖1A）。單個信號具有亞微米尺寸並且可以在多個焦平面中。因此，可能需要在整個樣品厚度上獲得圖像。然而，只要要比較的所有圖像都來自於樣本內的類似位置，就可以僅在一個平面中獲取圖像。值得注意的是，常在技術陰性對照（例如沒有一抗的對照，參見圖1B）中檢測到一些信號。然而，如果每十個細胞獲得超過一個或兩個信號，則可能需要進一步滴定一抗。

重要的是使用相同的設置（曝光時間、增益、使用的濾鏡等）來捕獲實驗中的所有圖像。可以使用陽性和陰性對照來優化設置。如果PLA信號的數量很大，PLA信號會融合/結合在一起（參見圖2）。這種情況會發生在研究高度表達的蛋白質時，或者過度曝光的圖像捕捉過程中。在設置圖像採集時，必須小心設置，以獲得個體PLA信號。關於如何防止信號融合以及關於其他可能的優化方面，請參閱Duolink® PLA故障排除指南。