自然界中細菌通常以含有許多物種的群體形式存在，它們之間存在複雜的互作，並因此塑造了整個群落。關於它們之間互作的研究通常是體外的，由此得出的結果很難直接轉移至宿主相關的體內環境，因為存在空間和營養環境的差異。在植物微生物組相關領域，目前大多的互作聚焦於病原菌侵染的患病植物中的互作，健康植物中細菌的互作以及驅動群落組裝的機制依然缺乏研究。
很多互作研究利用共存網絡，它是基於物種丰度相關性進行的，不能證明直接的相互作用。因此利用複雜度降低同時還具有群落代表性的合成群落（SynComs）進行體內互作研究是比較可行的方案。
瑞士蘇黎世聯邦理工學院微生物研究所Julia A. Vorholt研究團隊在2022年5月30日發表在Nature Microbiology（IF：17.75）上的題為 Mapping phyllosphere microbiota interactions in planta to establish genotype–phenotype relationships 的論文對上述問題進行了研究。
https://doi.org/10.1038/s41564-022-01132-w
摘要
宿主相關的微生物群落中有數百種細菌共存，為多種細菌之間的相互作用創造了機會，反過來也為整體的群落結構形成做出貢獻。細菌之間這種自我組織的機制在很大程度上仍然不為人知。本文對葉際微生物群中的細菌相互作用進行了研究。我們通過將200個內生菌單獨添加到含15個成員的合成群落中並跟蹤其在模式植物擬南芥定殖後群落組成的變化，來篩選植物中的微生物相互作用。在植物中90%為負相互作用，系統發育關係相近的菌株對合成群落產生了一致的影響，這為性狀保守型提供了支持。群落變化可以很大程度由二元互作解釋，但是我們也鑒定到了多於兩個互作菌株的高階互作。進一步對放線菌門的兩個成員之間突出的互作進行研究發現，在氣微菌屬（AeromicrobiumLeaf245）存在時，類諾卡氏菌屬（NocardioidesLeaf374）減少了兩個數量級。我們在AeromicrobiumLeaf245中鑒定到了一個有效的抗菌肽酶，它可以導致NocardioidesLeaf374的裂解。一個相應的Leaf245突變菌株對於恢復Nocardioides在植物中的定殖是必須且充分的。這表明直接的細菌-細菌互作對原始觀察到的群落變化是必要的。本研究突出了合成群落篩選的能力並揭示了空間異質性環境中強烈的微生物互作。
結果
選擇並表徵合成群落
作者從擬南芥葉來源的細菌庫At-LSPHERE中選擇了系統發育多樣且代表性的高丰度15個菌株，組成了合成群落，稱為中心群落（focal community）（圖1）。並將At-LSPHERE中的其餘200個菌株和一些選擇的模式菌株對合成群落的影響逐個進行了研究。中心群落中的大多數菌株都能定殖在葉際，達到107-108cfu/gFW（圖1c）。按單菌株等比例混合的中心群落接種後測葉際樣品的16 S 擴增子，發現MethylobacteriumLeaf88,RhizobiumLeaf371 和Chryseobacterium Leaf405的相對丰度在10%以上。9個在1-10%之間，3個小於0.1%（圖1d）。單菌株去除和替換實驗表明中心群落非常穩定（附件）。
圖1 a. 實驗設計。b. 篩選的中心群落成員系統發育樹。c 各個菌株在葉際定殖情況。d. 擴增子測得的中心群落各成員相對丰度。
At-LSPHERE菌株的全局性互作圖譜
作者把200個At-LSPHERE菌株逐個接到中心群落，得到15+1成員。接種定殖葉際約三周後，記錄它們相對於未處理的中心群落的相對丰度變化（圖2a）。也做了中心群落成員自身作為外來接種菌株的處理。這些對照條件下中心群落組成無顯著變化，只有Leaf427作為外來接種菌時，Leaf33減少了（log2fold change:-2.52）。總之，這些結果驗證了中心群落的穩健性。
圖2 a. At-LSPHERE（外圈）和中心群落（內圈）的互作圖譜。紅色和藍色連線分別代表正/負相互作用，粗細代表變化倍數。最外圈的柱狀圖表示對中心群落的總效應值（overall effect size；PCA，PERMANOVA）。b. a中鑒定到的互作菌株成對接種變化。頂部代表中心群落在a中觀察到的倍數變化，作為reference。下面是成對接種 vs. 單接種的倍數變化。R1和R2代表兩次重複。c.MethylobacteriumLeaf88單接種或與Xylophilus Leaf220或Methylophilus Leaf408 雙接種或三接種在葉際的定殖情況。
200個測試菌中有57個與中心群落菌株有互作，共84個互作。其中90%是負的互作，表明了它們的競爭效應。系統發育距離近的菌株對中心群落有相似的效應，大部分負相互作用發生在系統發育距離近的菌株之間（圖2a）。PseudomonasLeaf129除外，它也經常和遠距離菌株互作。對於中心群落中同屬內至少三個負互作的菌，作者測試了它們的互作，發現RhizobiumLeaf371,Sphingomonas Leaf67和Methylobacterium Leaf88是屬內負互作的，暗示相近菌株的競爭。有趣的是，其中一些互作在之前的62個成員的合成群落中也是存在的，表明這些互作即使在更複雜的情況下也存在。
除了Aeromicrobium Leaf245外，所有具有20%以上效應值的菌都與至少兩個中心菌株互作。Serratia Leaf50 有27%（最高的）效應值，與四個中心菌株互作，暗示其重塑群落的強大力量。事實上，這個菌株和植物病原菌Pseudomonassyringae pv. tomato DC3000是唯一在群落中出現時還能在某些植物引起疾病的菌（附件），這和已報道Serratia Leaf50是植物病原菌一致，且揭示了它對中心群落的強大影響。
為測試這些互作是二階或高階的，作者進行成對接種與單接種比較並測cfu。7/12互作可以在成對接種重現（圖2b）。與單接種相比，與中心菌株負互作的RhizobiumLeaf68 和Acidovorax Leaf76、Leaf160在成對接種中沒有明顯變化，暗示偏害共生（amensalism）。Xanthomonas Leaf148 和 中心菌株Aeromicrobium Leaf272互作：Leaf272共接種比單接種丰度上升，Leaf148不變，表明偏利共生（commensalism）。
成對接種不能捕捉到高階互作，作者就做了三接種。因為Xylophilus Leaf220也與Methylophilus Leaf408互作（圖2a），因此Leaf220可能對Methylobacterium Leaf88和Leaf408互作是必須的。的確作者重現了Leaf88和初始篩選得到的相當比例的丰度下降（圖2c）。有趣的是，Leaf220丰度無論是與Leaf408還是Leaf88共接種都會上升，暗示支持Leaf220的相似機制，可能和Leaf408、Leaf88都是甲基營養型菌株有關。
Nocardioides Leaf374 –Aeromicrobium Leaf245的互作
在體外的18個抑制性互作中，2個在體內也鑒定到（附件），其中包含NocardioidesLeaf374 (Leaf374) 和AeromicrobiumLeaf245。作者選這一對還因為Leaf374在體內有50倍丰度的下降（圖2a）。作者在植物體內順序接種它們，進一步驗證此結果。發現接種順序不重要，即使是已經定殖的Leaf374，Leaf245也能降低它的丰度（圖3a）。二元驗證和初始植物體內篩選的Leaf374下降程度相當。Leaf245的無細胞上清就足以抑制Leaf374（圖3b），甚至還能裂解Leaf374細胞（附件）。煮沸或加入有機溶劑之後，抑制能力消失，於是作者推斷抑菌活性分子是蛋白。作者把Leaf245培養上清分離得到一些有抑制活性的蛋白（圖3c，d），並把它們在大腸桿菌中異源表達。在這些蛋白中，有一個推定的M23家族內肽酶（ASF05_00205）導致了抑制和裂解（圖3e）。
圖3 a. Leaf374單定殖或與Leaf245共定殖。b. Leaf374和Leaf245活細胞或無細胞上清的體外互作。c. 體積排阻色譜對Leaf245上清進行分級分離。d. Leaf245上清中（見c）和第二次生物學重複中觀察到的蛋白SDS-PAGE。箭頭是質譜鑒定到的蛋白。e 純化的候選蛋白體外對Leaf374的抑菌活性。
為進一步證明Leaf374的抑制是由Leaf245上清中的蛋白引起的，作者進行了功能缺失突變體的構建。但是全部失敗。於是作者利用化學誘變來尋找體外抑菌活性消失的突變體。篩選了經EMS誘變產生的超過10,000個克隆，鑒定到56個全部或部分抑菌活性消失的突變體。最終選擇了33個保留最多2%活性的克隆進行了全基因組測序（圖4a）。ASF05_00210位點在40%分析菌株中存在突變，它編碼3 kb的注釋為轉錄激活子且直接位於之前鑒定到的細菌裂解蛋白ASF05_00205上游（圖4b）。ASF05_00205也在一個突變株中突變，相應的蛋白顯示出對Leaf374減弱的抑菌活性。突變的蛋白不能裂解Leaf374細胞（附件）。這個重要的突變是S70L。在鑒定到的剩餘的克隆，包括上面描述的，未發現其它預測的效應蛋白存在突變（附件）。作者還在兩個其它的克隆中發現了潛在的調節突變。對這些克隆和ASF05_00210突變體進行上清分級分離發現它們不再能分泌ASF05_00205內肽酶（圖4c）。
圖4 a. Leaf245抑菌功能缺失突變體重測序。ASF05_00210 (紅色) 和ASF05_00205 (黃色) 突出顯示。b. 編碼調節子ASF05_00210（紅）和效應子（黃）的基因對在Leaf245基因組的位置。c. 野生型Leaf245中的活性蛋白和相應的EMS誘變突變體中的部分的蛋白的SDS-PAGE。d. 單接種或與野生型Leaf245或突變體共接種時，Leaf374在擬南芥的定殖。
為測試Leaf245突變體是否不再抑制Leaf374的定殖，作者把它們做了共接種實驗。首先發現，Leaf245突變體單接種與其突變體有相似的定殖密度（附件），表明變化不是Leaf245定殖本身引起的。相比與野生型共接種，Leaf374在與Leaf245 ASF05_00210突變體（不能分泌 ASF05_00205 效應子）共接種時，丰度提高了20倍，與攜帶ASF05_00205 S70G突變的效應子分泌弱化的突變體共接種時丰度上升了10倍。這和體外抑制實驗的結果一致。然而，同樣不能分泌效應子 ASF05_00205 的E_12和E_48突變體則沒有影響Leaf374的定殖。可能是因為在植物體內和體外有不同的調控模式。Leaf374的增加並沒有影響Leaf245的定殖（附件）。
總之，Leaf374的體內定殖由推定的M23家族內肽酶ASF05_00205影響。它受ASF05_00210調節。作者把它們分別命名為Nocardioideslysis-associatedpeptidase (NlaP) andregulator (NlaR)。
Nlap的靶標範圍和它在其它物種的普及程度
作者想探索NlaP是否在其它細菌中也存在，作者搜索了Integrated Microbial Genomes (IMG) 數據庫。結果搜索到了At_LSPHERE中的Aeromicrobium種Leaf289、Leaf272 和Leaf291。在前面的篩選中鑒定到了Leaf289和Leaf374的互作（圖2a）。此外還鑒定到了At-RSPHERE中的Terrabacter spp.。它們含有nlaP 和 nlaR，在基因組上相互鄰近但方向相反（圖5a）。
圖5 a. 與ASF05_00205（nlaP，紅色）相比，Leaf245和包含相似基因鄰域的示範菌株的基因組區域。b. 編碼nlaP和nalR同源物的候選菌株和不含nlaP的Aeromicrobium對照菌株的體外活性。c.Aeromicrobium 和Terrabacter對一系列放線菌的體外抑制。
所有的Terrabacter spp.都對Leaf374有強烈抑制作用（圖5b）。作者發現缺乏nlaP的Aeromicrobiumspp.（Root236, Root344 and Root495）在體外不能抑制Leaf374（圖5b）。接下來作者選擇了含內肽酶活性的At-LSPHEREAeromicrobium spp.和At-RSPHERETerrabacter Root85對At-L-和At-R-SPHERE的放線菌門的菌的活性（圖5c）。At-LSPHERE、At-RSPHERE和少數其它菌株的活細胞都可以抑制Nocardioides spp.，且是密度依賴性的。無細胞上清的作用僅限Nocardioides spp.和非常相近的Marmoricola sp. (Leaf446)。AeromicrobiumLeaf245 和TerrabacterLeaf85 的上清比其它菌株的活性更強，暗示它們分泌更多蛋白或擁有更強活性的蛋白。這也許解釋了Aeromicrobium spp.和Leaf374在體內互作強度的差異。
最後作者也分析了對Leaf374有抑制作用的純化的蛋白Nlap ASF05_05375和 ASF05_12180（圖3e） 的抑菌譜。它們對Nocardioidesspp.和Marmoricolasp. Leaf446都有抑制作用，證明了內肽酶依賴的對此組菌負相互作用的專一性，並為未來研究這一迄今為止研究甚少的細菌群的靶標特異性提供了基礎。
通訊作者
Julia A. Vorholt，來自瑞士蘇黎世聯邦理工學院微生物研究所。主要研究環境如何塑造細菌生理學，重點是植物微生物群。在不同的尺度上進行功能分析，從代謝物和蛋白質水平到單個細胞、細菌群落、植物-微生物相互作用和生態系統。研究涉及一系列互補的學科和方法，包括代謝組學、（元）蛋白質組學、轉錄組學、顯微觀察、代謝工程，以及用於單細胞分析的納米技術新工具。實驗室主頁：https://micro.biol.ethz.ch/research/vorholt.html
發表文章187篇，其中包含多篇CNS及其子刊文章。總被引18447次，H指數70。https://scholar.google.ch/citations?user=B2U54GAAAAAJ&hl=de
Schäfer, M., Vogel, C.M., Bortfeld-Miller, M. et al. Mapping phyllosphere microbiota interactions in planta to establish genotype–phenotype relationships. Nat Microbiol 7, 856–867 (2022). https://doi.org/10.1038/s41564-022-01132-w
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