自新冠病毒肆虐以來，關於康復者二次感染、復陽 的案例屢見不鮮。此前醫學專家普遍認為造成復陽的原因是人體免疫系統無法抵禦冠狀病毒的持續攻擊。近日，MIT 分子生物學家 Rudolf Jaenisch 團隊的一項研究揭示了另外一種可能。
該研究指出，SARS-CoV-2 RNA 可以逆轉錄並整合到人類基因組中。簡單理解，就是病毒並沒有在人體內消失，而是通過逆轉錄與人體 DNA 結合進行了隱藏，這可能是造成患者復陽的原因。
圖 | 論文 「SARS-CoV-2 RNA reverse-transcribed and integrated into the human genome」 （來源：bioRxiv）
目前，該研究論文發表在了預印平台 bioRxiv 上，一經上線就引發了業內激烈討論。值得注意的是，對此研究的評論呈現出兩種截然相反的態勢，有專家認為這是一項 「頗具啟發性的研究」，但也有觀點質疑 「這項研究是否具有生物學意義」。
香港大學病毒學專家金冬雁教授就認為，這項實驗是 「站不住腳」 的。按照實驗的推論，如果 RNA 病毒可以通過逆轉錄整合進入人體 DNA，那麼通過常見的流感就可能改變人體的基因。但實際上，現代醫學還從未發現過流感病毒基因整合到人類基因組的痕迹。
SARS-CoV-2 RNA 可以逆轉錄並整合到人類基因組
起初，Jaenisch 團隊是對感染新冠的患者初次痊癒後數周或數月核酸檢測復陽的結果感到好奇。儘管有報道稱復陽的原因是再次感染病毒造成的，但對痊癒者進行嚴格隔離措施後，仍然能夠從他們身上獲取到病毒信息，並且這些病毒並不具備複製屬性和傳染屬性。
作為正鏈 RNA 病毒，SARS-CoV-2 和 SARS-CoV-1、MERS 等乙型冠狀病毒一樣，利用 RNA 聚合酶來複制基因組 RNA 及轉錄亞基因組 RNA。但從康復者的檢測樣本中未發現病毒的複製屬性，研究人員由此推斷出一種可能，SARS-CoV-2 RNA 逆轉錄並整合到人類基因組中，整合的 DNA 拷貝的轉錄可能導致 PCR 陽性的結果。
為證實上述推論，該團隊通過體外細胞實驗，利用新冠病毒和人體 LINE-1 逆轉錄酶或 HIV-1 逆轉錄酶，獲得了三個發現：
感染培養細胞和（復陽）患者細胞中的嵌合轉錄物表達與病毒序列的基因組整合一致；
為了研究病毒轉錄、整合到人類細胞核中基因組的可能性，研究人員分析了 SARS-CoV-2 感染細胞的 RNA-Seq（轉錄測序）數據。通過對來自新冠確診患者肺部、心臟、大腦、胃部及 BALF（支氣管細胞灌洗液）等細胞樣本的轉錄測序數據分析，發現大量樣本細胞中都可能存在人體基因組及病毒基因的嵌合序列。
這些組合序列一般佔總樣本的 0.004% - 0.14%，其中來自重症新冠患者 BALF（支氣管細胞灌洗液）細胞的組合序列高達 69.24%。
圖 | cov2 嵌合讀數在已發表的 RNA-Seq 數據集中可映射讀取數比例
並且大部分嵌合序列 RNA 都來自 SARS-CoV-2 的核衣殼（N）序列。而核衣殼 (N) 是 SARSCoV-2 亞基因組 RNA 中含量最高的 RNA，因此最有可能成為逆轉錄和整合的靶點。研究人員認為，這些分析支持了 SARS-CoV-2 RNA 可能會逆轉錄整合到感染細胞的基因組中，併產生嵌合病毒 - 細胞轉錄物。
SARS-CoV-2 RNA 可以在過表達逆轉錄酶的細胞中逆轉錄並整合到人類基因組中；
為了進一步印證 SARS-CoV-2 RNA 逆轉錄和整合，研究人員在 HEK293T 細胞中過表達人體 LINE-1 或 HIV-1 逆轉錄酶，並用 SARS-CoV-2 感染轉導細胞。
圖 | SARS-CoV-2 RNA 可以逆轉錄並整合到宿主逆轉錄酶在細胞中的表達
考慮到核衣殼（N）RNA 是最有可能實現逆轉錄整合的靶點，研究人員選擇了 4 套核衣殼（N）靶向 PCR 引物對純化的細胞 DNA 進行擴增，並對細胞基因組 DNA 進行了凝膠電泳分析。研究人員不僅確認了核衣殼（N）序列，還從 CMV-LINE-1 過表達細胞的基因組 DNA （gDNA）中克隆出了全長核衣殼（N）DNA，並通過 Sanger 測序確認了其序列。
在感染的 2 天后，用 PCR 或熒光原位雜交檢測細胞的病毒序列。結果證實，在同一組過表達 LINE-1 的感染細胞中，核衣殼（N）的信號比例（約 35%）明顯高於未過表達 LINE-1 的感染細胞（約 12%）。轉染 LINE-1 的感染細胞（約 80% 的轉染效率）出現核衣殼（N）信號陽性的比例（約 30%）明顯高於未轉染的細胞（13%）。感染但未轉染的細胞也表現出核衣殼（N）信號，儘管頻率較低（約 10%）。
以上實驗進一步證實，SARS-CoV-2 RNA 可以在體外被過表達的內源性逆轉錄酶逆轉錄。
SARS-CoV-2 RNA 和細胞能夠誘導人體 LINE-1 表達，與逆轉錄整合相關；
人體內的 LINE-1 不僅是自主逆轉錄轉座子，也有助於非自主元件的逆轉錄轉座子。基於 LINE-1 的這一特殊性，研究人員發現，當感染 SARS-CoV-2 時 LINE-1 在 Calu3 細胞中的表達量上調了約 3-4 倍。此外，對 Calu3 細胞 DNA 的 PCR 分析顯示，感染後 SARS-CoV-2 N 序列的逆轉錄整合，可能來自細胞因子激活的 LINE-1 逆轉錄酶。
圖 | 在 SARS-CoV-2 感染和含細胞因子的條件培養基處理下，細胞系 1 作為內源性逆轉錄酶源在人類細胞中表達
雖然 LINE-1 在人體內基因組的佔比達到 17%，但實際上其活性較低，50 萬份拷貝中僅有 100 份處於活躍狀態。為了研究細胞因子是否能夠單獨誘導 LINE-1，研究人員用含有細胞因子的培養基來培養骨髓細胞、小神經膠質細胞、CART 細胞，通過 PCR 分析發現內源性 LINE-1 表達上調了 2-3 倍。
研究人員還指出，LINE-1 表達在 SARS-CoV-2 感染後的細胞 RNA-Seq 數據中顯著上調，與嵌合序列的丰度相關。也就是說，通過逆轉錄整合進入人基因組的新冠病毒序列可能是亞基因組片段，因為整合序列大多集中在核衣殼（N）附近，因此也不具備感染性。
Jaenisch 團隊表示，實驗證實了 SARS-CoV-2 RNA 可以通過逆轉錄酶逆轉錄並整合到人類基因組中；並且 LINE-1 的表達可在 SARS-CoV-2 感染或暴露於細胞因子後被誘導，表明了 SARS-CoV-2 在患者體內逆轉整合的分子機制；整合的片段最有可能是 SARS-CoV-2 亞基因組片段。SARS-CoV-2 RNA 逆轉錄解釋了病毒暴露後，在沒有檢測到傳染性病毒的情況下，為何病毒序列仍然存在。
研究引發熱議，真實體內情況不支持實驗結論
研究人員總結認為，如果 LINE-1 序列在人體細胞中自然產生 RT（逆轉錄酶），那麼確診感染新冠的患者身體里可能已經發生了病毒與 DNA 結合的情況。除此之外，對於同時感染了新冠和艾滋的患者來說，體內可能也已經發生了這種整合變化。
該實驗為核酸檢測不到患者體內病毒的殘留提供了一種可能性的分析。與此同時，也對目前依靠 PCR 檢測新冠及治療方法有效性提出了一些擔憂。
圖 | 新冠病毒 （來源：Science）
「目前僅發現逆轉錄病毒以及與之類似的乙型肝炎病毒能夠把核酸整合到宿主 DNA 中。逆轉錄病毒必須通過整合才能不斷複製並組裝新的病毒，但新冠病毒並不是逆轉錄病毒。在 MIT 的這項實驗中，從細胞外人為地加入過量的逆轉錄酶，才導致 RNA 逆轉錄成為 DNA 的結果。但實際上，人體細胞中並沒有這麼多的逆轉錄酶，所以這個實驗更偏向一種『假說』，與人體細胞內的真實環境與可能出現的實際情況有很大出入。」 金冬雁教授告訴 DeepTech。
中國醫學科學院研究員、原北京協和醫學院教授王晨光也指出，新冠病毒和逆轉錄病毒在感染宿主後的行為有本質的區別。逆轉錄病毒相當於病毒劫持了宿主，並把自己變成了宿主身體內的一份子。而新冠病毒在感染宿主細胞後，不像逆轉錄病毒那樣 「反客為主」，病毒核酸在宿主細胞中只能進行複製和蛋白質得以表達產生，最終完成病毒顆粒的組裝。
大家熟知的典型逆轉錄病毒還有 HIV，它可以通過自身 RNA 產生酶進行逆轉錄變成 DNA，再通過不斷複製融合進入人體的基因組。而新冠病毒是通過 RNA 聚合酶完成複製，中間不會有逆轉錄到 DNA 的過程。此外，新冠病毒的複製過程都是在細胞質里完成的，而 DNA 主要集中在細胞核之中，所以新冠病毒的複製過程並不會觸碰到 DNA。
實際上，在人類進化過程中，已經有大量的病毒或細菌 RNA 整合進入人體 DNA，但大多數的整合基因組都被證實是沒有任何功效的。
儘管質疑聲不斷，也有部分專家學者對該實驗給予了肯定。《科學》雜誌援引美國著名病毒學家、艾滋病毒發現者 Robert Gallo 評論稱，雖然對實驗的完整性持懷疑態度，但我非常喜歡這項研究，我猜實驗是正確的。
值得注意的是，針對該實驗及衍生的疫苗討論正不斷升級。有學者指出 「病毒 RNA 可以逆轉錄整合進入人體 DNA，那基於蛋白合成的 mRNA 疫苗也可以通過逆轉錄整合進入人體 DNA，這將導致注射疫苗後的人類基因被改變。」
金冬雁向 DeepTech 解釋了 mRNA 的特性，首先 mRNA 壽命很短暫，從幾十分鐘到幾小時不等。而且 mRNA 在體內體外都很容易碰到 RNA 酶而被降解，哪怕人體的汗液、眼淚和唾液都有 RNA 酶。所以 mRNA 疫苗要放在零下 70°C 才能保存其活性。其次 mRNA 進入的細胞也是有壽命的，會自然死亡。針對新冠病毒抗原的抗體和免疫細胞形成後，也會幫助人體徹底清除帶有 mRNA 疫苗的細胞，所以這些細胞不可能一直停留在身體內，根本不會導致所謂的疫苗逆轉錄為 DNA 造成基因改變。
王晨光也指出，mRNA 核酸疫苗僅僅包含病毒的一個編碼蛋白的核酸序列，其病毒核酸物質既不能被整合到人體基因組 DNA，也不能在細胞內複製擴增。細胞不僅沒有被劫持，反而利用 mRNA 合成的蛋白質裝備了一隻武器精良的僱傭軍來防範新冠病毒。
雖然整個實驗過程缺乏直接性證據證明新冠患者體內的病毒整合進入了 DNA，這也是很多學者詬病此項研究的主要原因，但這種假設確實為病毒研究提供了一定的價值，尤其是為未來防範、規避 RNA 病毒風險的時候。不放過每一種可能，大概就是生物學最大的魅力。
澳大利亞國立大學約翰柯廷醫學研究院，遺傳與表觀遺傳方向博士生張旌對本文亦有貢獻
