引言
在細胞中成千上萬的RNA分子是如何準確無誤地抵達各自的目的地，從而指導蛋白質的合成，調控複雜的生命活動？從疾病的發生髮展到神經元的精細分化，RNA的「空間定位」（RNA localization）扮演着舉足輕重的角色。然而，長期以來，一個核心挑戰始終困擾着研究人員：我們如何才能在活細胞中，精準地「指揮」這些內源性RNA，去探究它們獨特的空間排布究竟如何塑造生命？
傳統的研究手段，往往需要對基因組進行繁瑣的工程改造，耗時耗力，且效果有限，尤其在高度複雜的原代神經元中更是難上加難。這使得對細胞內「空間轉錄組」（spatial transcriptome）功能意義的探索，長期處於停滯狀態，如同擁有一張細胞的「地圖」，卻缺乏探索地圖上「未知領域」的工具。
5月21日 《Nature》 的研究報道「Programmable control of spatial transcriptome in live cells and neurons」，研究人員開發出一種名為CRISPR介導的轉錄組空間組織（CRISPR-TO，CRISPR-mediated transcriptome organization）的創新技術，如同為RNA量身打造了一部「時空穿梭機」。CRISPR-TO巧妙地利用了核酸酶失活的Cas13（nuclease-dead dCas13）——這位「RNA導航員」，通過可編程的引導RNA（guide RNA, gRNA），結合化學誘導的「開關」系統，實現了對細胞內源性RNA定位的精準、可逆控制。
這項技術不僅能將RNA精準「投遞」到線粒體外膜、P-小體、應激顆粒等各種亞細胞區室，更能實現沿微管的雙向主動運輸，讓我們能實時觀測並操控RNA的「細胞之旅」。尤其在高度極化的原代神經元中，CRISPR-TO展現了前所未有的威力，它能夠將特定的mRNA（如β-肌動蛋白mRNA）運輸到軸突末梢，不僅促進了動態絲狀偽足的形成，還出人意料地影響了軸突再生。除此之外，CRISPR-TO還能進行高通量功能篩選，首次識別出像Stmn2 mRNA這類對神經元生長具有驅動作用的關鍵分子。CRISPR-TO的問世，無疑為空間轉錄組學領域架起了一座橋樑，填補了現有成像和測序技術的空白，為我們大規模、高通量地探究RNA在生命活動和疾病發生中的神秘功能，打開了全新的視野。
CRISPR-TO：給RNA裝上「時空穿梭機」的秘密武器
傳統的RNA定位研究方法，往往需要繁瑣的基因工程來刪除或修改RNA上的特定調控元件，這不僅效率低下，而且這些元件大多是未知的，還可能影響RNA的穩定性和翻譯。而CRISPR-TO則另闢蹊徑，它利用了核酸酶失活的Cas13（nuclease-dead dCas13）——一種RNA引導的、具備高效特異性RNA結合能力的工具，但它不會切割RNA。
dCas13就像一個聰明的「快遞小哥」，而引導RNA（guide RNA, gRNA）則是它手中的「地址條」。CRISPR-TO系統的核心，就是巧妙地將這個「快遞小哥」與特定的「定位信號」（subcellular localization signal）或「分子馬達蛋白」（motor proteins）連接起來。為了實現精準控制，研究人員還引入了一種化學誘導的二聚化（chemical-inducible dimerization）系統，以植物激素脫落酸（ABA）作為「開關」。脫落酸在哺乳動物細胞中具有良好的正交性，並且能夠穿透血腦屏障，是理想的誘導劑。
當脫落酸被添加時，它會促使dCas13與「定位信號」或「分子馬達蛋白」結合，從而將dCas13以及它所結合的目標RNA一同引導到預設的亞細胞區室。這項技術支持兩種模式的RNA定位：被動擴散和停靠（passive diffusion and docking），以及主動運輸（active transport）。
初露鋒芒：將RNA精準「投遞」到線粒體外膜
CRISPR-TO的首次亮相，是將報告mRNA（reporter mRNA）精確地定位到細胞的線粒體外膜（outer mitochondrial membrane, OMM）上。研究人員設計了靶向GCN4元件的gRNA，並觀察到驚人的效果：在ABA處理下，高達74.5%的報告mRNA被成功定位到OMM上，而對照組（DMSO處理或非靶向gRNA）的比例則僅為12.7%和13.9%。表明，CRISPR-TO介導的RNA招募是可誘導且依賴gRNA的。
不僅如此，CRISPR-TO還能精準調控內源性RNA。研究人員將甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）mRNA——一種參與糖酵解和RNA調控的關鍵基因——定位到OMM。單分子RNA FISH（single-molecule RNA FISH）技術證實了定位的特異性。同樣，在靶向gRNA（gT）和ABA處理下，74.5%的GAPDH mRNA成功定位到OMM，遠高於對照組的12.7%和13.9%。這展現了CRISPR-TO對內源性RNA的強大操控能力。
該系統還成功將包括β-肌動蛋白（ACTB）mRNA和線粒體氧化磷酸化亞基編碼mRNA（SDHC、SDHD和NDUFS2）在內的多種內源性mRNA定位到OMM，即使它們表達水平不同，效果依然顯著。此外，CRISPR-TO在不同細胞類型和物種中都表現出良好的通用性，包括人HeLa細胞、人HEK293T細胞和小鼠Neuro-2a神經母細胞瘤細胞。在穩定表達CRISPR-TO組分的HeLa細胞中，OMM定位的GAPDH mRNA比例從0%顯著提高到65%，這進一步證明了其在不同傳遞方法下的靈活性。
在測試不同的Cas13系統時，研究發現dPspCas13b展現出最高的RNA重定位效率，而dRfxCas13d和dLwaCas13a則效果不佳。這提示dCas蛋白的內在特性對CRISPR-TO的效率有顯著影響，為未來的優化提供了方向。
揭秘CRISPR-TO的「高效秘籍」：探尋RNA定位的決定因素
CRISPR-TO的高效並非偶然，研究人員深入探究了影響其性能的關鍵因素：
mRNA表達水平：研究發現，雖然OMM上dCas13的定位水平在不同mRNA表達水平下保持相對穩定，但OMM上定位的mRNA百分比卻與表達水平呈負相關（Spearman相關係數r = -0.73）。這意味着CRISPR-TO在定位中低表達水平的mRNA時效果更佳，但在高表達水平（例如每細胞約1.2 × 10^5個mRNA顆粒）下，仍然能夠檢測到顯著的OMM富集。
dCas13結合位點數量：為了確定有效RNA定位所需的最小dCas13結合位點數量，研究測試了不同GCN4重複序列數量的報告mRNA。結果顯示，三個GCN4重複序列就足以實現50.6%的OMM中位mRNA定位，這表明僅需三個dCas13結合位點即可有效介導RNA組織。
gRNA數量：單條gRNA即可誘導GAPDH mRNA定位到OMM，但兩條或三條gRNA能夠顯著提高效率。這提示dCas13結合位點對目標mRNA具有多價效應。
gRNA設計原則：研究人員進一步探索了影響CRISPR-TO性能的gRNA設計因素。通過線性回歸和置換特徵重要性分析，他們發現讀取覆蓋度（read coverage）對CRISPR-TO效率具有最強的正向影響（置換均值0.30，係數0.49），而脫靶命中（off-target hits）則表現出最顯著的負面效應（置換均值0.23，係數-0.44）。gRNA二級結構的影響相對較小。這提示，選擇3'UTR區域中具有中等讀取覆蓋度並最大程度減少脫靶的gRNA靶點，能夠實現更好的CRISPR-TO效率。
值得關注的是，CRISPR-TO對目標RNA的穩定性、分佈和翻譯影響有限。六種內源性mRNA的摺疊變化率均低於20%，這表明CRISPR-TO通過靶向3'UTR對RNA的這些基本屬性影響極小。此外，CRISPR-TO的脫靶潛力較低。對不匹配gRNA的檢測顯示，75%的不匹配gRNA顯著降低了RNA重定位效率，表明CRISPR-TO對錯配敏感。使用兩條gRNA能夠進一步增強特異性，因為同時結合兩條gRNA的脫靶RNA可能性較低。
RNA的「環球旅行」：定位多細胞器！
CRISPR-TO的通用性遠不止OMM。研究人員將其應用範圍擴展到六個額外的亞細胞區室，包括：
細胞質P-小體（cytoplasmic p-bodies）：GAPDH mRNA的富集率達到15.4%，對照組分別為7.0%和4.2%。
應激顆粒（stress granules）：GAPDH mRNA的富集率高達54.1%，對照組分別為20.2%和20.1%。
核端粒（nuclear telomeres）：TERRA非編碼RNA在端粒上的定位從對照組的23.3%-26.8%提高到40.2%。
核應激體（nuclear stress bodies）：報告mRNA的定位率達到33.0%，對照組分別為17.9%和10.9%。
這些結果證實了CRISPR-TO能夠通過將PYL1與不同的亞細胞定位信號或分子馬達蛋白融合，實現對RNA的精準定位。
CRISPR-TO還被用於研究P-小體在mRNA周轉中的作用。當將GAPDH mRNA招募到P-小體時，GAPDH mRNA的丰度增加了1.3倍。此外，靶向定位報告mRNA到P-小體顯著降低了mRNA衰變常數（從0.041 h^-1降至0.031 h^-1），並增加了mRNA半衰期（從16.9 h增至22.7 h）。這些發現支持了P-小體作為mRNA儲存而非降解位點的模型。
除了被動擴散和停靠，CRISPR-TO還實現了沿着微管的主動RNA運輸。通過將PYL1連接到小鼠驅動蛋白KIF5B（前向運輸，KIF5B，負責將貨物運往微管正端）和人驅動蛋白KIFC1（逆向運輸，KIFC1，負責將貨物運往微管負端），研究人員成功將內源性GAPDH mRNA分別導向微管正端（細胞前沿）或負端（中心體）。統計分析顯示，69.0%的轉染細胞在細胞前沿積累了GAPDH mRNA，而23.9%的細胞在中心體積累了GAPDH mRNA，均顯著高於對照組。
CRISPR-TO的「時間魔法」：可誘導與可逆的動態操控
與以往方法不同，CRISPR-TO最獨特的優勢在於其可誘導性和可逆性，實現了活細胞中RNA定位的精確時間控制。
研究發現，在添加ABA後，dCas13在10分鐘內迅速定位到OMM，而mRNA的定位則在30分鐘後觀察到，並於4小時內達到平台期。這表明核糖核蛋白複合物的動力學比遊離蛋白慢。當ABA被移除後，dCas13和GAPDH mRNA均以相似的快速率解離，在1小時內恢復到基線水平。這種快速可逆性使CRISPR-TO成為實時操控RNA定位動力學的強大工具。
研究人員利用CRISPR-TO的可誘導性，在U2OS骨肉瘤細胞系中追蹤了報告mRNA的實時運輸動態。結果顯示，報告mRNA顆粒的平均運輸速度為0.57 ± 0.14 µm/s，與已報道的哺乳動物細胞中MS2標記mRNA向中心體運輸的速度（0.5-1 µm/s）一致。軌跡分析揭示了兩種不同的mRNA群體：一種表現出受限的亞擴散運動（sub-diffusive motion），可能是由於細胞質的擁擠；另一種則表現出超擴散運動（super-diffusive motion），對應於沿微管的主動運輸。
神經元里的「RNA奇遇記」：精準操控與實時觀察
神經元是高度極化的細胞，RNA的精準定位對其功能至關重要。CRISPR-TO在原代小鼠皮層神經元中的應用，無疑是其最具突破性的亮點之一。
研究人員使用KIF5A蛋白將內源性ACTB mRNA（一種在神經元生長和再生中發揮關鍵作用的RNA）運輸到神經元的軸突末梢（neurite tips）。他們首先證實CRISPR-TO組分和ABA處理對原代神經元培養物沒有顯著的神經毒性，這為後續的神經元實驗奠定了基礎。
在ABA處理24小時後，ACTB mRNA在神經元末梢的定位強度與DMSO對照組相比，增加了十倍。每個神經元末梢包含中位5個ACTB mRNA顆粒，而對照組中為零。沿着神經元的ACTB mRNA顆粒密度增加了3.2倍，達到每微米0.07個顆粒。此外，CRISPR-TO還能同時定位多種RNA，例如ACTB mRNA和Gap43 mRNA，進一步證實了其在神經元中的特異性。
與在OMM上的快速解離不同，ACTB mRNA從神經元末梢的釋放速度較慢，24小時後仍能檢測到中等水平。這可能表明在神經元末梢局部定位的mRNA周轉率較慢。
局部翻譯：讓RNA在「遠方」也能大顯身手！
RNA在神經元末梢的局部翻譯對於軸突生長、導向等過程至關重要。CRISPR-TO不僅能定位RNA，還能促進其局部翻譯。
研究人員使用一種可光轉換的熒光報告蛋白Dendra2來追蹤局部翻譯。在ABA處理下，神經元末梢的Dendra2綠色熒光恢復速度顯著加快，這表明局部翻譯更加活躍。翻譯抑製劑（如嘌呤黴素和茴香黴素）能夠完全消除這種恢復，進一步證實了活躍的局部翻譯。
雙色RNA FISH實驗顯示，在ABA處理的神經元中，ACTB mRNA與核糖體（ribosomes）在神經元末梢大量共定位，66%的ACTB mRNA顆粒與核糖體共定位，提示神經元末梢存在豐富的核糖體，可用於局部翻譯。超分辨率顯微鏡STORM成像進一步證實，ACTB mRNA、核糖體和活性翻譯位點（通過嘌呤黴素標記）在神經元末梢簇集並共定位，表明局部翻譯確實發生。儘管如此，只有一小部分被運輸的mRNA處於活躍翻譯狀態。
活細胞成像也捕捉到信使RNA（reporter mRNA）的動態，其中一些表現出沿神經元移動的更慢的運動速度，這與活躍翻譯的mRNA特徵一致。這些發現共同表明，核糖體可能與mRNA一同作為「乘客」從胞體運輸到神經元末梢，為局部翻譯提供了物質基礎。
RNA的「形態魔術」：調控神經元生長與再生
既然CRISPR-TO能夠精準定位RNA，那麼它能否影響神經元的形態和功能呢？研究人員將內源性ACTB mRNA運輸到原代小鼠皮層神經元的軸突末梢，並觀察其形態變化。
實驗發現，在ABA處理90分鐘後，神經元末梢出現了多個動態的絲狀偽足（filopodial protrusions），每末梢1-4個。而對照組（即使dCas13富集，但無靶向RNA）則沒有形成偽足。在長達7小時的觀察中，33%的神經元末梢在ABA處理後形成了動態偽足，遠高於DMSO對照組的16%。RNA FISH證實了內源性ACTB mRNA在神經元末梢的增加。
然而，令人驚訝的是，儘管ACTB mRNA定位增加了絲狀偽足的形成，但它卻抑制了軸突再生。在軸突損傷模型中，ABA處理顯著增加了軸突ACTB mRNA的定位。但在軸突切斷後，靶向gRNA處理的神經元在ABA處理下，軸突長度顯著縮短。這揭示了ACTB mRNA定位與神經元形態和再生之間一種出人意料的複雜關係。
海量篩選：解鎖更多RNA功能密碼！
CRISPR-TO的可編程性使其能夠進行高通量遺傳篩選，系統地探索空間RNA定位的功能作用。作為概念驗證，研究人員進行了CRISPR-TO陣列篩選，以檢查21種候選mRNA的神經元定位對神經元生長的影響。這些候選mRNA編碼的蛋白都與神經元生長或再生有關。
篩選結果令人驚喜，研究人員識別出四種對神經元生長有顯著影響的mRNA：Stmn2、L1cam、Tmsb4x和Rptor。其中，Stmn2編碼的Stathmin-2是一種微管結合蛋白，參與微管動力學、軸突再生和肌萎縮側索硬化症的病理過程。
RNA FISH驗證顯示，儘管Stmn2 mRNA在對照組的胞體和胞體近端神經元中也有發現，但CRISPR-TO擾動（gT + ABA）能夠有效地將Stmn2 mRNA招募到神經元末梢，每個神經元末梢中位有3個mRNA顆粒，而對照組中則為零。隨後的神經元生長實驗也證實了Stmn2 mRNA定位的功能作用：在ABA處理12小時後，表達靶向gRNA的神經元與非靶向gRNA對照組相比，神經元長度顯著增加。而逆向運輸Stmn2 mRNA則對神經元生長沒有顯著影響。這明確表明，Stmn2 mRNA在神經元末梢的特異性定位能夠促進神經元生長。
CRISPR-TO：開啟空間轉錄組學新紀元
CRISPR-TO的出現，無疑是空間轉錄組學領域的一項里程碑式突破。它克服了傳統方法的諸多局限，展現出多重優勢：
無需基因組改造：直接結合內源性RNA，簡化了操作流程。
多功能定位：能夠將RNA定位到多種亞細胞區室，包括OMM、P-小體、應激顆粒、端粒、核應激體以及微管正負端。
精準時空控制：可誘導和可逆的特性，使得實時研究RNA定位動力學成為可能。
適用於原代細胞：特別是在神經元等複雜原代細胞中的高效應用，為疾病研究提供了關鍵工具。
高通量篩選潛力：通過改變gRNA序列，可編程地靶向不同RNA，實現大規模功能性篩選。
當然，CRISPR-TO目前仍有提升空間，例如多組分遞送的複雜性以及dCas13蛋白質的進一步優化。但可以預見的是，隨着技術的發展，未來有望實現單載體系統、更緊湊的dCas13變體，以及由計算算法優化gRNA效率和特異性。
CRISPR-TO不僅彌合了測序和成像技術留下的關鍵空白，更提供了一個通用平台，用於在活細胞和生物體中高通量地功能性探究RNA定位。這項技術有望為我們深入理解空間RNA組織在各種細胞類型和疾病背景下的生物學功能，提供寶貴的見解。RNA的「時空穿梭機」已經啟動，讓我們拭目以待，它將如何重塑我們對生命編程的認知！
參考文獻
Han M, Fu ML, Zhu Y, Choi AA, Li E, Bezney J, Cai S, Miles L, Ma Y, Qi LS. Programmable control of spatial transcriptome in live cells and neurons. Nature. 2025 May 21. doi: 10.1038/s41586-025-09020-z. Epub ahead of print. PMID: 40399675.
聲明：本文僅用於分享，不代表平台立場，如涉及版權等問題，請儘快聯繫我們，我們第一時間更正，謝謝！
往期熱文：
Nature Genetics
| 告別「批量」模糊：首個大規模單細胞研究，解碼膠質母細胞瘤縱向演變的「個體差異」與「普遍規律」
Nature
| 為什麼你能快速上手新事物？原來是紋狀體pDMSt幫你搞定了「逐次試驗更新」
N Engl J Med
| 「壞膽固醇」剋星再升級？新葯Obicetrapib狂降近30%，心臟救星來了？
Nature
| 「誤會」致癌基因？研究揭示髓母細胞瘤起源新圖景：CNVs才是幕後「啟動者」！
The Lancet
| 肝癌一線治療大洗牌！CheckMate 9DW：雙免疫組合顯著延長晚期肝癌患者生命，生存率創紀錄
Nature | 耐葯癌細胞的末日鐵騎！揭秘溶酶體鐵引發的死亡風暴
