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文|嫋嫋
編輯|嫋嫋
前言
蛋白質和核酸可以通過液-液相分離形成無膜細胞器，用於在空間上組織細胞成分和反應。少突膠質細胞中，RNA 結合蛋白異質核核糖核蛋白 A2在運輸顆粒的MLO中攜帶mRNA靶標。
hnRNPA2會被酪氨酸蛋白激酶Fyn磷酸化，從而釋放mRNA。Fyn通過其SH3與hnRNPA2發生相互作用，但是hnRNPA2缺乏規範的SH3結合序列。
在Fyn-SH3表面確定hnRNPA2 LC的相互作用位點，提供了hnRNPA2 LC與Fyn相互作用的結構視圖，並展示單球狀結構域如何誘導無序MLO支架蛋白的相分離。
液-液相分離是一種被提議用於形成無膜細胞器的機制，MLO的LLPS可以在空間上組織細胞成分，並且由於濃縮反應物而被認為能夠加速酶促反應或者通過提供獨特的化學環境實現功能。
LLPS是一個平衡過程，涉及分子組裝成兩個或多個不同的相，這些相的濃度、結構和接觸可能不同。不同的MLO在細胞中執行不同的功能，並由多種細胞成分組成。RNA顆粒是一類富含RNA和RNA結合蛋白的MLO。
Fyn-SH3 與 hnRNPA2 LC 相互作用
hnRNPA2是一種RNA結合蛋白，參與前mRNA剪接、翻譯控制和mRNA運輸。它的結構域包括兩個N端的RNA識別基序，它們一起結合到被稱為A2響應元件的共有RNA序列上，隨後是低氨基酸序列複雜性的本質無序結構域。
hnRNPA2形成mRNA轉運顆粒，將mRNA帶到樹突和少突膠質細胞的局部翻譯位點。當顆粒到達局部翻譯位點時，Src家族酪氨酸激酶Fyn會磷酸化hnRNPA2，從而釋放用於翻譯的mRNA分子。
Fyn激酶除了催化結構域外還由幾個不同的Src同源結構域組成，其中SH3結構域介導蛋白質與目標蛋白質之間的相互作用，可能結合含有PXXP基序的肽，而SH2結構域主要與磷酸化酪氨酸結合。
Fyn最初處於封閉狀態，但在被磷酸化和激活時，它採取開放構象，使得SH2和SH3結構域可以與下游的靶標發生相互作用。
hnRNPA2和Fyn之間的功能相互作用，但Fyn激酶和hnRNPA2之間的物理相互作用仍不清楚，因為hnRNPA2缺乏典型的SH3結合基序。
利用核磁共振波譜Fyn-SH3與hnRNPA2 LC相互作用的區域，向未標記的hnRNPA2 LC中加入15N標記的Fyn-SH3來觀察其對NMR譜的影響，添加0.25摩爾當量的hnRNPA2 LC導致樣品呈現乳光與液液相分離一致。
隨着hnRNPA2 LC濃度進一步增加，NMR信號明顯降低，當15N標記的Fyn-SH3與hnRNPA2 LC的比例為1:2.5時，NMR信號完全消失。
Fyn-SH3滴定15N標記的hnRNPA2 LC時，隨着比例變為1:0.5，hnRNPA2 LC-Fyn-SH3的強度下降，而在1:1時信號完全消失，單獨使用hnRNPA2 LC不會發生相分離。
用帶有N端麥芽糖結合蛋白溶解度標籤的高度溶解的hnRNPA2 LC，即使在1:0.5的比例下混合標記的Fyn-SH3和MBP-hnRNPA2 LC，表明形成了大的NMR不可見物質，並且溶液變得渾濁。Fyn-SH3強烈誘導hnRNPA2 LC的相分離。
Fyn激活引發hnRNPA2和其他顆粒成分
混合後15N標記的hnRNPA2 LC至Fyn-SH3滴定的NMR信號強度降低且光學濁度增強。為了量化hnRNPA2 LC的相分離與Fyn-SH3濃度的關係，隨着Fyn-SH3濃度的增加，hnRNPA2 LC WT的濁度增加至等摩爾濃度的Fyn-SH3。
在6小時內每次滴定的濁度短暫增加，然後逐漸恢復到基線水平，這可能是由於液滴粗化或沉降和粘附到孔壁所致。
在1:1和1:2時，觀察到相似的時間過程和最大濁度值。僅在1:10時，濁度在6小時時間點之前還沒有恢復到基線。隨着Fyn-SH3濃度的增加，D290V和P298L樣品的濁度也增加，與hnRNPA2 LC WT相似。
對比Fyn-SH3和hnRNPA2 LC樣品觀察到的濁度是由液液相分離引起的，在Fyn-SH3上放置了Alexa Fluor標籤，並通過突變表面暴露的絲氨酸殘基為半胱氨酸，使其遠離已知的脯氨酸結合位點。
在0mM NaCl緩衝液中，添加Fyn-SH3會誘導hnRNPA2 LC WT液滴的形成，而單獨的hnRNPA2 LC在這種濃度和溶液條件下不會發生相分離。熒光顯微鏡數據表明Fyn-SH3融入了液滴中。此外，Fyn-SH3也誘導hnRNPA2 LC D290V突變體的液滴形成。
在增加鹽濃度下以確定Fyn-SH3是否在生理鹽條件下與hnRNPA2 LC的LLPS液滴相互作用。無論NaCl濃度如何，Fyn-SH3摻入hnRNPA2 LC WT液滴中，並且液滴的形態沒有改變。
這些結果表明Fyn-SH3和hnRNPA2 LC之間的相互作用不是由NMR實驗所用的低鹽條件造成的。
hnRNPA2突變體D290V和P298L導致液液相分離的hnRNPA2 LC液滴轉化為蛋白質聚集體。與Fyn-SH3結合會破壞或促進hnRNPA2從液體形式轉化為與疾病相關的聚集形式，對hnRNPA2 LC及其突變體D290V和P298L進行了孵育，其中有或沒有Fyn-SH3參與。
將Fyn-SH3添加到hnRNPA2 LC WT中並沒有改變液滴的形態，液滴主要保持圓形。相比之下，3小時後，沒有Fyn-SH3的情況下，hnRNPA2 LC突變蛋白呈現出不規則形狀，與不可逆聚集的形成一致。
然而，當將Fyn-SH3添加到hnRNPA2 LC P298L突變體中時，3小時後，聚集轉變為不規則結構，而液滴形態再次出現。對於D290V突變體，同時觀察到聚集和液滴，但不如P298L突變體那麼顯著。
此外，Fyn-SH3仍然會融入hnRNPA2 LC P298L液滴中，儘管隨着時間的推移有聚集的趨勢。鹽對hnRNPA2突變體聚集的影響，使用生理學150mM NaCl的緩衝液代替0mM NaCl。
與低鹽不同，即使存在Fyn-SH3，hnRNPA2 LC在150mM NaCl下仍然聚集。3小時後，無論有或沒有Fyn-SH3，WT、D290V和P298L樣品仍然聚集。因此，Fyn-SH3無法在所有測試條件下阻止hnRNPA2 LC聚集。
Fyn-SH3 可能會減少 hnRNPA2相關突變體的聚集
然而，由於hnRNPA2 LC在添加Fyn-SH3後發生相分離，導致相互作用的蛋白質被發送到粘稠的相分離液滴中，這些液滴很難通過溶液NMR檢測到。
為了在NMR中識別相互作用位點，較小的hnRNPA2 LC片段將阻礙LLPS，但保留與Fyn-SH3結合的能力，從包含殘基266-341的hnRNPA2亞肽開始，在hnRNPA2中該結構域包含在hnRNPA2相關退行性中發生突變的殘基。
該亞肽還包含LC中9個脯氨酸殘基中的4個，它們可能充當SH3結構域的結合位點。幸運的是，在NMR緩衝液中測試的Fyn-SH3和hnRNPA2 266-341的混合物並未顯示出相分離現象。
用15N標記的Fyn-SH3與含有hnRNPA2 266-341的亞肽進行了1:1、1:1.5和1:2的滴定，並觀察到Fyn-SH3共振的化學位移擾動隨着hnRNPA2亞肽濃度的增加而增加，這表明Fyn-SH3和hnRNPA2 LC之間存在相互作用。
化學位移擾動主要出現在Fyn-SH3的RT環、β4鏈和遠端環中，與Fyn-SH3的結合表面區域重疊。尤其在β4鏈上的Thr-53和Gly-54以及RT環中的Leu-24顯示出最高的位移。
儘管這些混合物是穩定的並且不易發生相分離，但在1:2時，強度比降低至約0.7，這可能是由於高階組裝體的形成而發生的。
用15N標記的hnRNPA2 266-341與自然丰度的Fyn-SH3進行整個亞肽中的化學位移擾動，但在310-320區域觀察到一組較大的15N位移，表明Fyn-SH3與該區域的結合增加。
當Fyn-SH3以5摩爾當量添加到hnRNPA2 266–341中時，觀察到輕微渾濁和信號損失，但仍保留約60%的1:1信號，表明Fyn-SH3仍然可以誘導hnRNPA2的這個小截短的相分離。
用hnRNPA2 190-303的亞肽時，在標準條件下它立即沉澱。因此，在較低的pHhnRNPA2 LC不易組裝。在這種條件下，hnRNPA2 190-303在添加等摩爾的Fyn-SH3後發生相分離。
因此，發生了蛋白質-蛋白質相互作用，但無法通過NMR對相互作用的位點特異性細節進行直接評估。該亞肽比266-341亞肽具有更多的脯氨酸殘基，因此，該區域可能是Fyn-SH3與hnRNPA2相互作用。
這些殘基在許多SH3結構域中都是保守的，表明它們對SH3功能很重要。Fyn-SH3 RT環中的殘基Asp-23和Leu-24在hnRNPA2 266-341中存在時表現出較大的化學位移擾動，這與其他研究中觀察到的富含脯氨酸的蛋白質結合的情況相似。
此外，截短的hnRNPA2 LC到Fyn-SH3結合時的一些化學位移擾動，其中最大的位移位於殘基314-325，該區域包含脯氨酸-酪氨酸核定位信號，可結合核轉運蛋白β-2。這暗示PY-NLS可能是hnRNPA2 LC中與Fyn-SH3結合的主要位點。
然而，完整的LC和N端片段與Fyn-SH3混合時，形成了比截短的266-341亞肽更低濃度的相分離，這可能是由於更高的親和力結合導致的。
總結
對於hnRNPA2 LC與Fyn-SH3的相互作用，Fyn-SH3-hnRNPA2接觸的模型。單個Fyn-SH3結構域可能是hnRNPA2 LC的多價結合平台，存在多個位點可以與hnRNPA2 LC結合，這種多價接觸可能導致hnRNPA2 LC分子之間的相互作用增強。
使Fyn-SH3誘導hnRNPA2 LC LLPS的生理作用不太可能，因為在hnRNPA2與存在於局部翻譯位點的膜束縛Fyn激酶相互作用時，hnRNPA2已經發生相分離。
相反，Fyn-SH3-hnRNPA2接觸可能有助於將Fyn摻入hnRNPA2顆粒中，從而在空間上控制Fyn和hnRNPA2激酶結構域的相互作用，導致hnRNPA2在需要局部翻譯的位點被磷酸化和顆粒解聚。
這種嚴格的空間和時間調控對於確保mRNA僅在需要的時間和地點進行翻譯至關重要，然而，顆粒解聚的分子細節以及其他激酶是否也通過類似的機制將相分離顆粒解離。
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