超聲(US)成像是一種安全的疾病診斷醫療工具，具有無創、非電離輻射、成本低和實時可視化等優點。為了提高成像質量和分辨率，人們開發了超聲造影劑，比如由蛋白質、脂質、聚合物和無機納米顆粒穩定的充氣微泡(MBs)，它可以提高超聲反射率並延長超聲信號在器官的停留時間。而MBs的超聲信號受殼層材料的物理化學性能影響較大，雖然交聯可以有效地增強聚合物殼層，增強MBs的穩定性，但其可壓縮性會進一步降低，非線性振蕩會得到很大的抑制，削弱造影效果。因此，如何解決MBs超聲造影劑的長期穩定性和造影效果之間的矛盾仍然是一個艱巨的挑戰。
基於此，中科大劉世勇教授、胡進明教授、中科大附屬第一醫院沈愛宗教授和何年安教授合作合成了一系列兩親性共聚多肽，並將其作為穩定填充有全氟化碳(PFC)的MBs的殼層材料。其中親水聚乙二醇(PEG)嵌段和氟化全氟聚甲醛嵌段分別構成MBs殼層的外層和內層。具有較低界面張力和較低拉普拉斯壓力的氟化嵌段與內部負載的八氟丙烷(C3F8)接觸時，可以提高MBs的穩定性。同時，作者還合成了側鏈中含有可交聯的二乙炔嵌段的共聚肽，UV誘導交聯能夠進一步提高了MBs的穩定性，但由於非線性振蕩被抑制，US信號下降。為了解決這一問題，作者合成了末端帶有馬來酰亞胺(MI)的共聚物，通過原位Michael加成反應與白蛋白等血漿蛋白共價偶聯後，MI修飾的MBs的非線性振蕩明顯增強。
圖1 雙親共聚多肽的合成和MBs的製備
MBs的製備及表徵
共聚多肽在PBS緩衝液中水化得到半透明懸浮液，在50 oC下進一步攪拌48 h得到膠束分散液。然後，向其中加入C3F8並將溫度降至0oC，在超聲作用下得到負載C3F8的MBs，而且改變超聲時間可以調控MBs的尺寸。在4oC放置14天，負載C3F8的MBs的尺寸和數目也沒有發生明顯的變化，而商用SonoVueTMMBs的粒徑明顯增大，數目明顯減小，這可能是由於負載氣體的外泄。共聚多肽穩定的MBs在放置14天後，通過手搖即可完全恢復其宏觀外觀，尺寸從~2.4 μm略微增加到~3 μm。
圖2 共聚多肽穩定的MBs的表徵
共聚多肽穩定的MBs在體外的超聲成像性能
然後，作者研究了製備的MBs在不同BSA濃度下的對比增強超聲成像(CEUS)性能。圖像的原始灰度值為98，當BSA濃度為1、3和10 g/L時，孵育1 min後，其灰度值分別增強至135、170和198。除了增強信號強度外，BSA共價結合能夠反射二次諧波信號，大大增加了US成像時間窗口。在CEUS模式下，共聚多肽穩定的MBs經10 g/L BSA孵育後，在300 s內信號強度僅減弱20%，而SonoVueTMMBs在相同孵育時間下信號明顯減弱。體外成像實驗表明，SonoVueTMMBs在120秒後失去信號。相比之下，共聚多肽穩定的MBs僅在管的底部變暗，而頂部在300 s後仍保持明亮，說明該MBs具有更高的信號強度和更長的成像窗口。
圖3 共聚多肽穩定的MBs的體外超聲成像性能
共聚多肽穩定的MBs的體內超聲成像性能
接下來，作者進一步評估了共聚肽穩定的MBs在家兔體內的US成像性能。經靜脈注射共聚多肽穩定的MBs後，取兔的肝臟和腎臟進行B模式和CEUS模式US成像。共聚多肽BP1穩定的MBs提高對比度的效果不明顯，而在CEUS成像模式中，共聚多肽BP5穩定的MBs和商業產品SonoVueTMMBs的信號都得到了改善，這表明BP5穩定的MBs具備作為一種高效的超聲造影劑的潛力。與BP1穩定的MBs相比，BP5穩定的MBs在體內的US成像能力顯著增強，這可能歸因於MI基團與血漿蛋白的原位結合，進一步表明白蛋白的結合可以顯著增強BP5穩定的MBs的US信號。然後，作者研究了靜脈注射BP5穩定的MBs和SonoVueTMMBs後，兔肝臟和腎臟在B模式和CEUS模式下的灰度值隨時間的變化。BP5穩定的MBs的B模信號衰減相對較慢，100 s時的一諧波增強是SonoVueTMMBs的兩倍。而在CEUS模式下，BP5穩定的MBs的灰度值始終高於SonoVueTMMBs。與BP1 穩定的MBs相比，BP5 穩定的MBs在B模式下圖像強度與之相似，而其在CEUS模式下的灰度值(~120)是BP1穩定的MBs(~70)的1.7倍。這是因為血漿蛋白能夠通過MI基團原位偶聯到BP5穩定的MBs上，改善了MBs的非線性振蕩。
圖4 經典B模式和CEUS模式成像性能
小結：作者合成了嵌段共聚多肽，並用於穩定全氟化碳，得到尺寸可控、尺寸分佈窄的MBs，可進一步用作超聲造影劑。由於界面張力較低，MBs的穩定性得到很大提高。此外，交聯還可以進一步增強MBs的穩定性，與市面上的SonoVueTMMBs相比，其成像時間窗口更長。更重要的是，作者提出了一種原位表面修飾的方法，將白蛋白共價偶聯到MBs表面以增加MBs的二次諧波信號強度，解決了基於MBs的超聲造影劑長期穩定性和對比度增強持續時間短的矛盾。
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原文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202209610
來源：高分子科學前沿
