撰文 | 言笑
急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）的特點是未成熟髓系前體的克隆增殖伴隨分化受阻。與正常的造血作用類似，AML按層次結構組織，白血病幹細胞（leukemic stem cells, LSCs）負責補充AML細胞的大量種群並驅動長期克隆增殖【1-2】。幹細胞在正常和惡性造血作用中都具有非常重要的作用，但調節LSCs和正常幹細胞生長和分化的因素尚未完全闡明。
線粒體中產生的代謝中間體（包括乙酰輔酶A、α酮戊二酸、S-腺苷甲硫氨酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）通過作為核基因表觀遺傳修飾的輔助因子來調節幹細胞功能和分化【3-4】。代謝酶（如IDH1和IDH2）的突變會產生腫瘤代謝物，導致組蛋白和DNA甲基化增加，促進白血病發生並抑制分化【5-6】。雖然已有研究證實代謝產物調節幹細胞功能，但對於定位在細胞核中的直接影響基因表達、細胞分化和幹細胞功能的線粒體代謝酶知之甚少。
近日，來自加拿大瑪格麗特公主癌症中心的Aaron D. Schimmer團隊在Nature Cell Biology雜誌上在線發表了題為The metabolic enzyme hexokinase 2 localizes to the nucleus in AML and normal haematopoietic stem and progenitor cells to maintain stemness的文章。研究人員發現，糖酵解途徑中的起始酶和限速酶己糖激酶 2（hexokinase 2, HK2）可以定位於AML和正常造血功能的幹細胞和祖細胞的細胞核中。細胞核HK2以不依賴其激酶和代謝功能的方式調控幹細胞/祖細胞功能和分化。該研究描述了一種線粒體酶調節基因表達和幹細胞功能的非經典機制。
為了探究那些傳統定位於線粒體的代謝酶是否可以在細胞核中兼職（moonlight in the nucleus）並直接影響幹細胞功能和分化，作者對8227細胞（這是一種低傳代原代AML模型【7】）中的線粒體糖酵解酶和三羧酸循環酶進行了分析，並在細胞核中檢測到了HK2（糖酵解途徑中的第一個酶，它將葡萄糖轉化為葡萄糖-6-磷酸）。相比之下，其他代謝酶（包括磷酸果糖激酶、延胡索酸酶、丙酮酸激酶2等）在核裂解液中並未檢測到。隨後，作者在7個原發性AML樣本中也檢測到了核HK2。進一步，根據活性氧水平的高低，作者將原發性AML樣本分細分為白血病幹細胞（stem population）和大量群體（bulk population），並檢測了這兩組樣品中的核HK2水平。與bulk cells相比，stem cells中的核HK2顯著增強。
那麼AML幹細胞和祖細胞功能是否需要核HK2? 作者構建了c-Myc（NLS1, PAAKRVKLD）或SV40（NLS2, PKKKRKV）核定位信號標記的HK2，選擇性地增加細胞核中的HK2，發現核HK2過表達可以促進8227細胞植入小鼠骨髓。從第一受體骨髓中採集8227細胞繼續移植到第二受體，核HK2過表達依舊可以提高植入效率。OMMLS-HK2（outer mitochondrial membrane-localizing signal, OMMLS）可以選擇性地定位到線粒體中。與對照細胞相比，表達OMMLS-HK2的細胞對2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）具有更強的抵抗性（圖1a和b），表明線粒體標記的蛋白質具有代謝活性。隨後，作者用靶向內源HK2的shRNA轉導過表達OMMLS-HK2的細胞以消除核HK2，同時保留線粒體中的HK2（圖1c）。結果顯示，核HK2敲低後，（1）降低了NB4細胞的克隆生長（圖1d）和8227 LSCs（CD34+CD38-）數量（圖1f）；（2）減少了AML細胞在體內的生長和移植；（3）降低了與原始/幹細胞樣AML組分相關基因的表達，增加了細胞對ATRA（all-trans-retinoic acid, 全反式維甲酸）的敏感性（圖1d和e）；（4）降低了ATRA處理後CD34+ CD38−幹細胞的百分比（圖1f）。這些數據表明，核HK2對於AML中的幹細胞功能和分化至關重要。
圖1. 敲低核HK2降低幹細胞和祖細胞功能
作者還探究了HK2在正常造血幹細胞和祖細胞中的核表達和功能。造血幹細胞（hematopoietic stem cells, HSCs）和多能祖細胞中HK2的核表達水平和總水平均較高，並隨着細胞成熟而下降，分化細胞中核HK2的表達量最小。正常臍帶血中核HK2的過表達增加了這些細胞移植到小鼠體內的原發性和次級移植率。進一步，作者構建了過表達核HK2的轉基因小鼠（Vav-NLS-HK2），選擇性地增加造血系統中的HK2。Vav-NLS-HK2小鼠骨髓中HSCs丰度及增殖能力顯著增加，表明核HK2對正常HSCs的功能也很重要。
HK2是一種轉移酶激酶，可將線粒體外膜處的葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸，起始糖酵解。那麼HK2激酶活性是否是維持幹細胞特性所必需的？Asp209和Asp657（D209A/D657A）的雙重突變將使HK2完全喪失激酶活性。作者構建了一個帶有c-Myc NLS標記的HK2突變體（NLS1-HK2 D209A/D567A）。在細胞中過表達NLS1-HK2 D209A/D567A後，用ATRA進行處理，依舊可以增強克隆生長和阻斷細胞分化，與過表達野生型核HK2的表型類似。因此，核HK2以一種不依賴於其激酶和代謝活性的方式維持幹細胞和祖細胞功能。
最後，作者分析了HK2維持細胞乾性的機制。通過BioID（proximity-dependent biotin labelling）聯合蛋白質譜初步篩選出12個與核HK2相互作用的蛋白，它們與染色質組織和調節（CTR9，MAX，PHF8，PHF10和SPIN1）、轉錄調控（AASDH，CCNL2，IWS1和ZNF136）和DNA損傷反應（SIRT1，TDP2和UBR5）相關。進一步通過原位鄰位連接分析（Proximity ligation assay, PLA）證實了HK2與MAX、SIRT1、IWS1、CTR9和SPIN1之間的相互作用。隨後，作者通過ATAC-seq發現，核HK2的過表達增加了染色質的可及性。HK2與MAX相互作用，MAX與細胞增殖、幹細胞維持和分化以及DNA損傷響應有關，作者因此檢測了stem和bulk AML群中的DNA損傷響應，並探究了核HK2是否會影響DNA損傷修復。在細胞中過表達核HK2後，用daunorubicin（一種插入化療劑，可導致雙鏈DNA斷裂）處理細胞；然後，通過量化細胞核中γH2AX（雙鏈斷裂的替代標誌物）、53BP1（介導非同源末端連接修復）和RAD51（同源重組）水平，在daunorubicin處理後的多個時間點檢測雙鏈DNA斷裂和DNA修復蛋白的表達。結果顯示，核HK2過表達增加了53BP1和RAD51水平，並減少了雙鏈斷裂的數量。作者還比較了AML stem與bulk細胞中的DNA損傷反應。白血病幹細胞對 DNA 損傷有反應，與同源重組和非同源末端連接相關的基因表達增加。
綜上所述，該研究描述了線粒體代謝酶HK2的非經典功能（兼職「moonlighting」功能）：（1）HK2定位於白血病和正常造血幹細胞的細胞核；（2）核HK2過表達可以增加白血病幹細胞特性並降低分化；敲低細胞核HK2促進分化並降低幹細胞功能；（3）核HK2調控幹細胞功能和分化不依賴於其激酶活性和代謝功能；（4）HK2與調節染色質開放性的核蛋白相互作用，增加DNA修複位點的染色質可及性；（5）核HK2過表達可減少DNA雙鏈斷裂並賦予化學抗性，這有助於理解白血病幹細胞抵抗DNA損傷劑的機制。
原文鏈接:
https://doi.org/10.1038/s41556-022-00925-9
製版人：十一
參考文獻
1. Kreso, A. & Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell 14, 275-291 (2014).
2. Wang, J. C. & Dick, J. E. Cancer stem cells: lessons from leukemia. Trends Cell Biol. 15, 494-501 (2005).
3. Gut, P. & Verdin, E. The nexus of chromatin regulation and intermediary metabolism. Nature 502, 489-498 (2013).
4. Moussaieff, A. et al. Glycolysis-mediated changes in acetyl-CoA and histone acetylation control the early differentiation of embryonic stem cells. Cell Metab. 21, 392-402 (2015).
5. Ward, P. S. et al. The common feature of leukemia-associated IDH1 and IDH2 mutations is a neomorphic enzyme activity converting α-ketoglutarate to 2-hydroxyglutarate. Cancer Cell 17, 225-234 (2010).
6. Figueroa, M. E. et al. Leukemic IDH1 and IDH2 mutations result in a hypermethylation phenotype, disrupt TET2 function, and impair hematopoietic differentiation. Cancer Cell 18, 553-567 (2010).
7. Lechman, E. R. et al. miR-126 regulates distinct self-renewal outcomes in normal and malignant hematopoietic stem cells. Cancer Cell 29, 214-228 (2016).
轉載須知
【原創文章】BioArt原創文章，歡迎個人轉發分享，未經允許禁止轉載，所刊登的所有作品的著作權均為BioArt所擁有。BioArt保留所有法定權利，違者必究。
