實驗研究：九龍藤黃酮抑制自噬抗心肌缺氧損傷的作用機制

2022年10月11日17:44:49 健康 1525

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）以心肌缺血和缺氧為特徵，其發病率和死亡率高，嚴重危害人類健康[1]。誘發心肌缺血損傷的因素有多種，包括氧化應激、鈣超載、炎症反應、凋亡、自噬和壞死等，其中自噬在心肌缺血的發生髮展中起重要作用。自噬是長壽蛋白和胞質細胞器降解和再循環的重要過程[2]，在心肌細胞缺血缺氧時抑制自噬有利於心肌細胞的存活，並減輕心肌損傷[3]。

九龍藤黃酮（Bauhinia championii flavones，BCF）是廣西民族特色草藥九龍藤Bauhinia championii (Benth.) Benth.的主要活性成分，本課題組前期研究表明，BCF具有抗炎、抗氧化的作用，能夠通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路，抑制細胞凋亡及過度自噬，抗心肌缺氧損傷[4-6]；細胞實驗發現上調miR-384-5p能增強BCF抑制自噬的作用[4]，但在整體動物水平，miR-384-5p對BCF的作用尚不明確。

研究表明，長鏈非編碼RNA（long non coding RNA，LncRNA）能夠發揮微小RNA（microRNA，miRNA）海綿作用，競爭性結合miRNA的反應元件，進而對其靶基因進行負向調控[7]。LncRNA心肌梗死相關轉錄本（myocardial infarction associated transcript，MIAT）參與了心肌梗死、動脈粥樣硬化等多種疾病過程[8]，如結合miR-150部分增強心肌肥厚，結合miR-26a抗動脈粥樣硬化[9-10]，但LncRNA MIAT參與心肌梗死的分子機制仍有待深入研究。LncRNA MIAT能否通過「分子海綿吸附」作用結合miR-384-5p影響自噬，參與心肌缺血損傷尚無相關報道，其對BCF的心肌保護作用也未闡明。本研究基於LncRNA MIAT/miR-384-5p信號軸探究BCF對心肌缺氧損傷的作用及機制，為臨床治療心肌缺血損傷提供實驗依據。

結果

BCF下調LncRNA MIAT並上調miR-384-5p基因表達

如圖1所示，與對照組比較，OGD組細胞中LncRNA MIAT基因表達顯著上調（P＜0.01），miR-384-5p基因表達顯著下調（P＜0.01）；與OGD組比較，BCF組細胞中LncRNA MIAT基因表達顯著下調（P＜0.01），miR-384-5p基因表達顯著上調（P＜0.05）。

LncRNA MIAT靶向調控miR-384-5p

雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示（圖2），共轉miRNA-384-5p和LncRNA MIAT-WT後熒光素酶活性顯著降低（P＜0.001），說明miRNA-384-5p與LncRNA MIAT互作。RAP實驗進一步驗證兩者的作用關係（圖2-C），miRNA-384-5p被LncRNA MIAT探針富集，表明LncRNA MIAT與miR-384-5p存在相互作用。如圖2-D、E所示，與sh-NC組比較，敲低LncRNA MIAT後LncRNA MIAT基因表達降低（P＜0.001），而miRNA-384-5p基因表達升高（P＜0.05）。上述結果表明miR-384-5p是LncRNA MIAT的靶基因，並受到LncRNA MIAT的負調控。

敲低LncRNA MIAT抑制自噬減輕心肌缺氧損傷

如圖3-A、B所示，與對照組比較，OGD組細胞存活率顯著降低（P＜0.001），心肌缺血損傷標誌物cTn-I水平顯著升高（P＜0.001）；敲低LncRNA MIAT能夠提高H9c2細胞存活率（P＜0.01），降低cTn-I水平（P＜0.01），提示下調LncRNA MIAT能減輕OGD誘導的心肌缺氧損傷。

進一步驗證LncRNA MIAT對OGD誘導的H9c2細胞自噬的影響，如圖3-C～E所示，與對照組比較，OGD組自噬小體及自噬溶酶體數量增多（P＜0.01），Beclin1蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-I值升高（P＜0.001），p62蛋白表達水平降低（P＜0.001）；與sh-NC組比較，敲低LncRNA MIAT後自噬小體及自噬溶酶體數量減少（P＜0.01），Beclin1蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-I值降低（P＜0.01、0.001），p62蛋白表達水平升高（P＜0.001），表明敲低LncRNA MIAT能抑制OGD誘導的心肌細胞自噬。

BCF對OGD誘導的H9c2細胞存活率和上清液中cTn-I水平的影響

如圖4所示，與OGD組比較，BCF組細胞存活率顯著升高（P＜0.01），上清液中cTn-I水平顯著降低（P＜0.001）；敲低LncRNA MIAT可增強BCF的作用（P＜0.01、0.001）。

BCF對OGD誘導的H9c2細胞自噬小體的影響

如圖5所示，與OGD組比較，BCF組自噬小體數量顯著減少（P＜0.01）；敲低LncRNA MIAT可增強BCF的作用（P＜0.01）。

BCF對OGD誘導的H9c2細胞自噬相關基因及蛋白表達的影響

如圖6所示，與OGD組比較，BCF組細胞中Beclin1、Cathepsin D及LC3基因表達水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），Beclin1和Cathepsin D蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01），LC3-Ⅱ/LC3-I值顯著降低（P＜0.01）；敲低LncRNA MIAT可增強BCF對OGD誘導的H9c2細胞自噬的抑制作用（P＜0.05、0.01）。

BCF對OGD誘導的H9c2細胞自噬流的影響

如圖7所示，與OGD組比較，BCF組細胞中自噬體和自噬溶酶體數量均顯著減少（P＜0.01）；敲低LncRNA MIAT後自噬體和自噬溶酶體數量進一步減少（P＜0.05），表明BCF通過下調LncRNA MIAT抑制自噬體和自噬溶酶體的形成，從而阻滯自噬流。

敲低LncRNA MIAT對大鼠心臟miR-384-5p基因表達的影響

如圖8所示，與對照組比較，AMI組大鼠心臟中miR-384-5p基因表達顯著下調（P＜0.001）；敲低LncRNA MIAT顯著增加心臟中miR-384-5p基因表達（P＜0.05）。

沉默miR-384-5p基因表達逆轉BCF的抗心肌缺血損傷作用

如圖9所示，與AMI＋BCF組比較，沉默miR-384-5p後給予BCF處理，大鼠心肌梗死面積增加，梗死率顯著升高（P＜0.01）；血清中cTn-I水平顯著升高（P＜0.01），心臟組織中自噬相關基因及蛋白表達均顯著上調（P＜0.01），心肌缺血損傷加重。

討論

AMI是一種嚴重的致命性疾病，由冠狀動脈阻塞引起的心肌缺血損傷是造成患者死亡的原因之一[13]。目前，臨床治療AMI的主要方法為經皮冠狀動脈介入（percutaneous coronary intervention，PCI），PCI能夠較快且安全地恢復血流再灌注，但其發病血管仍有急性再閉塞的可能性[14]。一些活血化瘀中藥具有防治心血管疾病的作用，深入研究其作用機制，有望為開發防治AMI的藥物提供依據。

自噬在AMI中的發生機制、調控因素及藥物干預為近年研究熱點[2]。自噬是一個動態的過程，包括自噬體形成（一般以Beclin1、LC3II為標誌）、自噬體與溶酶體融合（一般以Cathepsin D為標誌）和自噬體的降解（一般以p62作為標誌）3個連續的步驟。細胞在正常情況下很少發生自噬，而內質網應激、缺血缺氧等常誘導自噬[3]。九龍藤是一種傳統的中草藥和功能性食品，性平低毒，BCF是其莖提取物的主要活性成分，研究發現BCF可抗氧化、抑制細胞凋亡和自噬、減輕心肌缺血缺氧損傷[5-6]，但其具體的分子機制尚不清楚。本課題組前期研究表明miR-384-5p負調控Beclin1表達抑制自噬，過表達miR-384-5p可增強BCF的心肌保護作用[4]。本研究亦發現ODG誘導的H9c2細胞給予BCF預處理後，miR-384-5p基因表達上調，提示miR-384-5p可能參與了BCF抑制自噬的作用。

以雙熒光素酶報告基因實驗和RAP實驗探析miR-384-5p的上游靶點，結果顯示，LncRNA MIAT負靶向調控miR-384-5p。作為AMI的危險等位基因，LncRNA MIAT在AMI患者和小鼠血漿中高表達[15-16]，但LncRNA MIAT在OGD誘導的H9c2細胞中的作用尚未見報道。本研究發現，OGD誘導的H9c2細胞中LncRNA MIAT表達上調，敲低LncRNA MIAT可提高心肌細胞活力、降低cTn-I水平、減少自噬小體和自噬溶酶體數量、降低Beclin1蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-I值、增加p62蛋白表達、抑制心肌缺氧損傷。為進一步驗證BCF是否通過影響LncRNA MIAT發揮心肌保護作用，在敲低LncRNA MIAT基因的心肌細胞穩轉株中給予BCF預處理，結果顯示，與單純BCF預處理相比，合併敲低LncRNA MIAT後，BCF抑制自噬和減輕心肌缺氧損傷的作用顯著增強，說明LncRNA MIAT可能是BCF發揮心肌保護作用的重要靶點。

為進一步驗證miR-384-5p對BCF作用的影響，構建AMI動物模型，並通過在體轉染方式，沉默大鼠miR-384-5p基因表達。結果顯示，沉默miR-384-5p逆轉了BCF抑制自噬的作用，加重了大鼠心肌缺血損傷，提示BCF抗心肌缺血損傷作用可能與上調miR-384-5p基因表達有關。

綜上所述，本研究發現BCF通過LncRNA MIAT/miR-384-5p抑制自噬減輕心肌缺氧損傷（圖10）。由於LncRNA MIAT全長序列為8474 bp，序列太長，過表達後極有可能造成細胞死亡，因此本研究未對過表達LncRNA MIAT情況進行分析。後續將進一步在體內驗證BCF下調LncRNA MIAT抑制自噬減輕心肌缺血損傷的作用。