染色體異常是造成人類胚胎低着床率、妊娠失敗和出生缺陷的重要原因。自然妊娠的早期流產率約為15%-20%，體外受精－胚胎移植（In vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）的早期流產率約為25%，其中胚胎染色體異常約佔40-50%，新生兒染色體異常的發生率為0.5%-1%。對於患有染色體異常、單基因疾病、不明原因反覆自然流產和植入失敗的患者或其家屬，在接受遺傳諮詢後，可能會建議他們接受來自多個PGT平台的胚胎檢測，例如PGT-A&PGT- M，PGT-A&PGT-SR，甚至PGT-A&PGT-M&PGT-SR，以避免複發性流產和後代罹患遺傳病。目前的PGT-A/M/SR是由不同的技術平台執行的，其成本高、材料少、耗時長，推廣受限。
PGT困境：多指征需多平台，臨床需求難滿足
胚胎植入前基因檢測（Preimplantation genetic testing，PGT）能在胚胎植入子宮前對染色體數目和結構異常進行檢測，摒棄異常的胚胎（單基因異常胚胎、染色體結構重排胚胎和非整倍體胚胎），選擇正常的或不致病的胚胎植入母體子宮，可有效地降低流產率、提高妊娠率、減少有缺陷或嚴重遺傳疾病新生兒的出生。
PGT技術可有效提高胚胎種植率和妊娠率，降低流產率，防止遺傳性疾病患兒的出生。PGT包括三個方面的檢測，胚胎植入前遺傳學篩查（PGT for aneuploidy，PGT-A）、植入前胚胎單基因遺傳學檢測（PGT for monogenic/single gene defects，PGT-M）和植入前胚胎染色體結構變異遺傳學檢測（PGT for structural rearrangements，PGT-SR）。多種分子生物學技術和分子遺傳學技術可用於染色體遺傳檢測和分析，包括FISH（Fluorescence in situ hybridization）技術、PCR（Polymerase chain reaction）技術、aCGH（Array-based comparative genomic hybridization）技術、SNP-array（Single nucleotide polymorphism array）技術和NGS（Next Generation Sequencing）技術。
目前，PGT一體化解決方案主要有Karyomapping、Haplarithmisis、OnePGT、MARSALA、MaReCs、Haploseek、一體化cPGT、三重擴展分析、單基因缺失檢測、無創PGT、長讀測序等（表1）。OnePGT主要使用RRGS方法通過基於讀取計數的方法評估非整倍性和結構重排，並通過基於SNP的單倍型檢查單基因疾病。雖然可以從OnePGT數據中推斷出三倍體、單倍體和UPD，但OnePGT軟件並沒有自動提供這些信息；Haploseek平台適用於所有臨床PGT應用（PGT-A/M/SR）和de novo突變，在家庭成員信息完善的情況下，可成功應用於近親夫婦；基於WGS的一體化cPGT並沒有降低測序覆蓋率，而是利用另一種策略通過將胚胎樣本的測序深度降低到4倍來降低測序成本。它對PGT-A採用通用讀取計數分析，同時對PGT-SR（包括平衡易位）和PGT-M使用單倍型推導；另一種基於SNP陣列的綜合性PGT已被開發出來，它也檢測到非整倍體、CNV、單基因突變和平衡易位，但沒有說明CNV和嵌合體的起源。其PGT-A和CNV分析依賴於SNP等位基因頻率和Log-R比率，而PGT-M和PGT-SR利用連鎖分析。然而，SNP陣列受限於其固定數量的探針。
表1一體化PGT解決方案
數據來源：[1]丨製圖：生物探索編輯團隊
目前為止，沒有一項技術可以在一個工作流程里用一組試劑對一份胚胎樣本完成三種染色體異常的檢測和分析，同時區分染色體平衡易位者的正常型胚胎和易位攜帶型胚胎。為了克服一體化PGT相關的障礙，應用專家正在尋求將PGT-A、PGT-M和PGT-SR結合在單一檢測中。
HaploPGT：一體化PGT檢測技術可實現多指征同時檢測
2022年9月6號，國家人類幹細胞工程研究中心遺傳部、中信湘雅生殖與遺傳醫院、長沙市發展與致癌國際科技合作基地、貝康醫療、中南大學和上海交通大學聯合研究團隊在Human Reproduction發表題為「A novel multifunctional haplotyping-based preimplantation genetic testing for different genetic conditions」的研究成果（圖1）[2]。研究提供了一種多功能的基於單倍型的胚胎植入前遺傳學檢測平台，用於檢測不同的遺傳狀況。
圖1 研究成果（圖源：[2]）
此項研究收集了來自43個家系的188個胚胎樣本，並全部用HaploPGT平台進行了檢測，樣本大部分遺傳異常都是事先通過不同的常規PGT方法確定的。僅攜帶結構重排的有12個家庭（115個胚胎），其中9個家庭接受了植入，5個家庭的ART分娩結果正常，7個家庭僅攜帶單基因疾病（26個胚胎），3個家庭同時攜帶結構重排和單基因疾病（26個胚胎）。從21個家庭中收集了12個單核受精卵（1PN）樣本和9個疑似三倍體樣本。
結果發現：
01 80M基因組數據可平衡HaploPGT的成本和準確性
在8000萬條reads（80M）的基因組數據中，包含兩個或更多信息性單核苷酸多態性（SNP）位點的窗口（100萬個鹼基對（Mb））比例為97.81%，同時基因分型錯誤率穩定在較低水平（2.19%）；此外，信息單核苷酸多態性在基因組中分佈均勻，建立了全基因組單倍型（圖2）。因此，選擇80M來平衡HaploPGT中的成本和準確性。
圖2 不同大小測序數據以及80M數據單倍型的SNP分佈（圖源：[2]）
02 HaploPGT能識別異常胚胎，甚至可區分親本來源
測序數據覆蓋率低但讀取深度高，可以準確檢測全基因組的SNP，從而利用所有SNP的BAF來識別三倍體、二倍體和LOH。HaploPGT能夠識別三倍體、全雜合子和部分雜合子缺失的異常胚胎，甚至能夠區分鑲嵌和非鑲嵌胚胎中拷貝數變異的親本來源（圖3）。
圖3 檢測三倍體、雙親二倍體、單倍體和LOH（圖源：[2]）
03 HaploPGT與PGT檢測的可用結果100%一致
此外，通過對43個家族的188份胚胎樣本進行回顧性分析，HaploPGT與PGT檢測參考方法（包括PGT-A、PGT-M、PGT-SR和PGT-HLA）的可用結果顯示100%一致。
圖4 通過單倍型區分胚胎中的染色體重排（圖源：[2]
此項研究開發了一種命名為HaploPGT的一體化PGT檢測平台。HaploPGT對囊胚活檢樣本的RAD-seq數據進行拷貝數分析、BAF分析和單倍型分析，以執行PGT-A、PGT-SR、PGT-M和其他擴展應用。HaploPGT具有以下優勢：(i)WGS所需的數據量減少了，而可用於構建單倍型的有效SNP數量就足夠了；(ii)可以通過通用工作流程檢測父母、先證者和胚胎的單倍型；(iii)測序數據量非常少，工作流程通用，PGT-A、PGT-M和PGT-SR大大降低了成本、材料、複雜性和操作時間；(iv)可以展示其在其他功能上的應用，例如檢測1PN、三倍體、鑲嵌胚胎的鑲嵌比例或異常CNV的父母來源。以上胚胎狀況均在一次測試中展示，可以為醫生選擇更好的胚胎進行移植或進行科學研究提供更多信息。
圖5 HaploPGT概述（圖源：[2]
HaploPGT是一種高效且具有成本效益的檢測平台，在檢測遺傳狀態方面具有很高的臨床價值。該平台可以促進PGT在ART中的應用，提高妊娠率，減少遺傳病患兒的出生。儘管HaploPGT可以帶來許多好處，但它仍然需要更多的家庭成員信息來推斷親本單倍型，以識別受試胚胎的平衡易位和單基因突變。就PGT-SR而言，額外的家族成員可能是具有不平衡易位的參考胚胎。PGT-M通常需要先證者。在這兩種情況下，祖父母或父母兄弟姐妹的基因組信息可能有助於理論上的單倍體分型。另一個限制是HaploPGT無法區分單倍體和由單倍體複製產生的二倍體，但它能夠識別胚胎基因組中雜合性的部分丟失。此外，重排斷點的位置和突變位點的情況很複雜，這意味着可能無法完全檢測到部分遺傳病。
撰文|文競擇
排版|風立宵
End
參考資料：
[1]Volozonoka L, Miskova A, Gailite L. Whole Genome Amplification in Preimplantation Genetic Testing in the Era of Massively Parallel Sequencing. Int J Mol Sci. 2022 Apr 27;23(9):4819. doi: 10.3390/ijms23094819. PMID: 35563216; PMCID: PMC9102663.
[2]Xie P, Hu X, Kong L, et al. A novel multifunctional haplotyping-based preimplantation genetic testing for different genetic conditions. Hum Reprod. 2022 Sep 6:deac190. doi: 10.1093/humrep/deac190. Epub ahead of print. PMID: 36066440.
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