1939年一年中，國民黨的反共事件層出不窮。國民黨頑固派在加緊軍事反共準備時，加強在國統區域對中共的迫害。
1940年3月，在成都製造「搶米事件」，嫁禍於中共地下黨，趁機查封《新華日報》成都營業分銷處，逮捕有公開身份的該處負責人、中共川康特委書記羅世文和共產黨員車耀先等10餘人，殺害共產黨員朱亞凡和洪希宗二人。面對驟然惡化的時局，剛從國外歸來的周恩來，來不及洗去旅途的風塵，又踏上了新的征途。
5月10日，周恩來率孔原、徐冰等一批幹部分乘四輛卡車離開延安赴重慶。途經西安時，他會見了陝西省的軍政要員蔣鼎文等，抗議國民黨軍隊在邊區周圍製造磨擦，要求他們以抗日為重，迅速停止反共敵對行徑。途經成都時，應邀出席了四川地方實力派鄧錫侯（由他的代參謀長出面）舉行的歡迎宴會，並廣泛會見了成都各界民主人士。在宴會上和會見中，周恩來坦誠說明中共的主張，希望大家共同堅持團結抗戰，反對任何妥協投降活動。
周恩來於5月31日到重慶後，立即約見再次離開新四軍已在重慶的葉挺，他在和葉劍英、袁國平一同會見葉挺時，對葉挺說，你是我們新四軍的軍長，負有指揮新四軍全軍軍事工作的重大責任，中共中央信任你，相信你的軍事才能和為人，也相信你對革命事業的忠誠。你離開新四軍以後，蔣介石放出風聲說新四軍問題須重新解決，有派他人充任軍長之意，這樣於抗戰與民主事業很不利。希望你能回到皖南軍部去，帶領這支革命軍隊，多打些好仗，為中國和人民的解放事業做出更大的貢獻。你同項英的關係問題，項英應負主要責任，請相信黨中央和我會負責解決好。聽了周恩來親切真誠的談話，葉挺深受感動，當即表示將儘快告訴蔣介石願意回到新四軍去。接着，周恩來、博古、葉劍英同袁國平、饒漱石進行了幾次談話，傳達了中共中央對新四軍的指示，充分肯定新四軍一年多來的成績，嚴肅指出存在的問題，批評了項英的錯誤。要求新四軍領導尊重葉挺在軍中的地位，支持葉挺指揮全軍軍事。再次重申新四軍的發展方針，第一是江北，第二是蘇東，第三是蘇南和皖南；建立和發展根據地，首先是蘇北、皖北，其次是湖北。並明確告訴袁國平，今後有關新四軍問題的談判，不再由袁同顧祝同在上饒進行，一律移到重慶由周恩來自己負責。周恩來還主持召開南方局常委會，聽取了袁國平、饒激石就新四軍工作的全面彙報，並作了許多重要指示。
由於國民黨頑固派製造磨擦越來越嚴重，我黨不能不採取相應的方針、策略。6月初，周恩來傳達中共中央政治局會議精神，要求全體幹部清醒對待目前形勢，努力做好工作。從6月14日起，他連續主持南方局會議，聽取南方局機關、《新華日 報》以及各省、特委主要負責人的彙報，研究討論今後的工作。 要求一切在國統區的我黨各級組織，必須從組織上、領導方式上以及活動方法上來一個大的轉變，完全轉變為秘密的地下黨， 《新華日報》和辦事處也應改變工作方法和鬥爭方式，一切公開活動必須與地下黨分開，以便能在惡劣環境下，保存精幹力量，繼續展開黨的各項工作。這次南方局會議，是我黨在國統區里 建設堅強的戰鬥的組織邁出的十分重要的一步。
周恩來在南方局會議上，三番五次地要求各級黨組織和 廣大黨員，一定要十分重視統戰工作，強調要多做中間勢力的工作，或是主動上門或是請他們到住地，把時局的變化和中共抗戰對國民黨的主張坦白告訴他們，也把中共對廣大中間黨派人士的態度和希望如實地告訴他們，同他們進行坦率的商討。
周恩來只要一有機會，就到各階層群眾中去。比如：1940年9月29日，中華職業教育社邀請他演講，他欣然允諾，講了《國際形勢與中國抗戰》。這次演講原本安排在一個劇場進行，因到會的人太多，臨時改到巴蜀學校廣場。周恩來並不顧個人安危，同意到廣場演講。他從世界往哪個方向走；中國向哪個方向走；歐戰向哪個方向發展；日美關係向什麼方向發展；蘇聯保持什麼立場；中國採取什麼立場；日本能否結束中國事件；中國有沒有嚴重的困難和妥協投降危機；中國怎樣使抗戰進步等九個方面剖析了當時的國際形勢和中國抗戰的前途，指出帝國主義之間的戰爭正在持續擴大，中國正面戰場正面臨著嚴重的困難和 妥協投降危險，但只要我們立足於自力更生，勿對美日衝突存在幻想，堅持團結抗戰到底，勝利就一定屬於我們。他還用鐵的事實揭露國民黨的腐敗無能，許多官員借抗日營私，發國難財的可恥行徑。
這次演講，使大家耳目一新，興奮無比，3000多聽眾被周恩來深深吸引了。歷時4個多小時，廣場上鴉雀無 聲，連事先準備好前往搗亂起鬨的國民黨特務也忘記了自己的身份和聽眾一起鼓掌。周恩來的演講一掃了當時瀰漫於重慶的消極悲觀氣氛，廣大民眾受到極大鼓舞。
6月初，周恩來和蔣介石面談。他對蔣介石說：中共誠意抗戰，並擁護蔣委員長，而國民黨卻在抗戰中實行反共溶共剿共政策，這隻能幫助敵偽。所謂中共要舉行暴動推翻國民黨，純國造謠。中共的發展，主要是在敵占區與敵、汪爭群眾。蔣介石說：抗戰團結都是有決心的，國共間的一切問題都可以解決，但軍事上須服從命令。周恩來回答說：這要從兩方面看，一方面服從，另一方面不應拿命令脅迫。蔣介石說，這都是過去的事情了。最後，蔣表示國共關係問題可以商談。此後，國共兩黨在重慶開始第一次正式談判。
這次正式談判，中共方面代表是周恩來和葉劍英，國民黨方面代表是何應欽、白崇禧。周恩來首先向何、白遞交了我黨關於解決目前危局，加強團結抗戰的方案。要求國民黨政府保障各黨派之合法存在；釋放一切在獄之中共黨員；停止查禁各地之書報雜誌，給《新華日報》的出版發行以法律保障，允許登載中共文件及領導人之言論、文章；援助人民武裝，發動普遍的游擊戰爭；承認陝甘寧邊區隸屬行政院，並按現有23個縣的現狀劃界，以林祖涵為邊區政府主席；准許第十八集團軍 （八路軍）擴編為3個軍9個師，新四軍增編為7個支隊；同意在利於對日作戰情況下劃分作戰區域等。
在約一個多月時間裏， 雙方圍繞我黨提案進行了多次談判，而其中談得最多的又是承認邊區，擴編我軍和劃分作戰區域三大問題。
國民黨只承認邊區包括18個縣；八路軍擴編為3個軍6個師加6個團，新四軍編為兩個師；要求八路軍新四軍全部開到老黃河北岸去。
在這三大問題上，雙方分歧很大，難於接近。至7月16日，國民黨方面來了一個「提示案」，更要求取消邊區，縮編八路軍和新四軍，並限定在命令到達一個月之內，全部開往老黃河以北。這在事實上拒絕了中國共產黨提出的各項要求，使談判陷入僵局。
但是，為了團結抗戰大局，周恩來仍然表示願意攜帶這個「提示案」回到延安，和中央中央共同研討，尋找兩黨繼續談判和解決問題的辦法。
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