The Broad Institute of Harvard and MIT David Liu以及波士頓大學Ahmad S. Khalil等研究人員使用定向進化的策略篩選可以使用更兼容的PAM（protospacer adjacent motif）序列的可用於單鹼基編輯的功能性小Cas蛋白。該定向進化策略的特點是同時考慮與PAM序列的結合以及單鹼基編輯的功能；它主要整合了PAM識別的功能性Cas蛋白篩選、噬菌體輔助的高通量自動化細菌培養控制篩選平台以及快速PAM序列兼容性分析等技術(1–4)。
高兼容PAM序列的Cas蛋白定向進化篩選策略設計理念(1)
PAM識別的功能性Cas蛋白篩選(1)
噬菌體輔助的高通量自動化細菌培養控制篩選系統(1)
研究人員這種定向進化技術篩選出多種PAM序列兼容性好的小Cas蛋白變體，並且相對於其它已報道的類似的小Cas蛋白在某些場景有更高的效率或者更低的脫靶效應(1)。
該項工作2022年9月8日發表在nature biotechnology；研究人員表示更兼容的PAM序列將讓單鹼基編輯工具覆蓋更廣泛的疾病突變工具(1)。
Comment(s):
通用性很強的技術，畢竟高度可控的培養並高通量地獲取細菌培養狀態數據，還可以用於優化其它基因編輯/操縱系統等等。
此外，對細菌進一步工程化改造，設計整合潛在脫靶效應的定向進化篩選；或者結合定向進化、結構分析與理性設計，有望高效獲取更靈活實用的Cas變體。
參考文獻：
1. T. P. Huang et al., High-throughput continuous evolution of compact Cas9 variants targeting single-nucleotide-pyrimidine PAMs. Nat. Biotechnol. 2022, 1–12 (2022).
2. B. G. Wong, C. P. Mancuso, S. Kiriakov, C. J. Bashor, A. S. Khalil, Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nat. Biotechnol. 2018 367. 36, 614–623 (2018).
3. A. H. Badran, D. R. Liu, Development of potent in vivo mutagenesis plasmids with broad mutational spectra. Nat. Commun. 2015 61. 6, 1–10 (2015).
4. J. H. Hu et al., Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556, 57–63 (2018).
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41587-022-01410-2
